הזרקת זבובים דרוזופילה למבוגרים: שיטה של משלוח תרכובת או תווית

Overview

וידאו זה מתאר כיצד לבצע זריקה של זבובים בוגרים חיים וכולל פרוטוקול לדוגמה שבו חלקיקים שכותרתו כחול trypan מוזרקים בבטן לעוף כדי לעבור phagocytosis.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Nazario-Toole ו- וו, הערכת התגובה החיסונית התאית של זבוב הפירות, Drosophila melanogaster, באמצעות In Vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp. (2019).

1. הכן חלקיקי פלואורסצנטין להזרקה

1. לשקם 10 מ"ג של זמין מסחרית, חום נהרג חלקיקי חיידקים שכותרתו פלואורסצנטין (ראה טבלה של חומרים)לריכוז מלאי של 10 מ"ג / מ"ל על ידי הוספת 990 μL סטרילי 1x PBS ו 10 μL 50 mM נתרן אזיד. וורטקס לערבב.
   1. מחלקים ל-8 μL aliquots חד פעמיים בצינורות של 0.2 מ"ל ומאחסנים בקופסה כהה ב-4 מעלות צלזיוס כדי למזער את הרגישות הקשורה לאור.
      שים לב: חומר משמר נתרן אזיד הוא אופציונלי וניתן להשמיט אם 10 מ"ג / מ"ל מניות נעשים עם 1 מ"ל סטרילי 1x PBS, aliquoted, ומאוחסן ב -20 °C (60 °F).
2. הפוך פתרון 10 מ"ל של 5% צבעי מאכל ב 1x PBS על ידי ערבוב 500 μL מזרק מסונן צבעי מאכל ירוקים ו 9.5 מ"ל סטרילי 1x PBS.
3. לשטוף חלקיקים לפני הזרקה כדי להסיר נתרן אזיד. יש לערבב 42 μL סטריליים 1x PBS ו-8 μL של 10 מ"ג/מ"ל בצינור של 1.7 מ"ל. צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
   1. הסר את supernatant, להוסיף 50 μL 1x PBS, וצנטריפוגה במהירות מקסימלית במשך 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. חזור על שלבים 1.3 ו 1.3.1 2x, עבור סך של 3 שוטף.
   3. לאחר הכביסה הסופית, להשליך את החלקיקים supernatant להשעות מחדש ל 1.6 מ"ג / מ"ל ב 50 μL של 5% צבעי מאכל ב 1x PBS.
   4. לעטוף את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור. חנות ב 4 מעלות צלזיוס, להשליך לאחר 1 שבוע.

2. הכינו את תחנת ההזרקה וזבובים

1. הכינו את משטח ההזרקה. כדי להזריק עד 4 גנוטיפים של זבובים בו זמנית, השתמש בסרט מעבדה כדי לחלק משטח מעופף מלבני CO₂ ל -4 חלקים. על הספסל ליד המיקרוסקופ, לייעד אזורים למקם את הבקבוקונים פעם זבובים כבר בשורה על כרית (אחד עבור כל פינה של כרית).
2. הכינו בקבוקונים של זבובים תואמי גיל, בני 4-7 ימים, להזרקה. כדי שכל זן ייבדק, העבירו 5 זכרים ו-5 נקבות לבקבוקון טרי ומסומן של מזון זבובים מוכן ושמרו על 25 מעלות צלזיוס.
3. הכן את מזרק פנאומטי (ראה טבלה של חומרים)על ידי הגדרת המכשיר 100 ms (התפרצויות קצרות של לחץ גז לגרש את הנוזל – המאפשר משלוח של נפחים תת ננוליטר) מצב TIMED.
4. הכינו את שקופיות המיקרוסקופ. חותכים רצועות 1.5 אינץ' של סרט חשמלי, מקפלים לתוך לולאה עם הצד דבק החוצה, ומניחים על שקופית מיקרוסקופ שכותרתו.

3. הכנת מחטים נימי זכוכית

1. משוך מחטי זכוכית (נימי זכוכית דקים בקיר) באמצעות מושך מחט.
   1. החזק את המחט מתחת למיקרוסקופ עם מיקרומטר ולשבור את הקצה באמצעות פינצטה נירוסטה נקודה עדינה #5. 100 טיפים מיקרומטר מספיקים כדי לנקב את הקוטיקל של הזבוב תוך מזעור הפצע.
   2. למדוד את נפח הנוזל שיוזרק לתוך כל זבוב. לטעון את המחט עם סטרילי 5% צבעי מאכל ב 1x PBS לגרש את הנוזל על טיפה של שמן מינרלי על מיקרומטר שלב 0.01 מ"מ.
      שים לב: אם טיפת הנוזל כדורית, הנפח בפיקוליטרים מחושב כ- (גודל)³/1910. מחט בקוטר 100 מיקרומטר תפלט ~ 2 nL ב 100 ms.

4. להזריק זבובים

1. פיפטה 10 μL של 1.6 חלקיקי מ"ג / מ"ל על ריבוע קטן של parafilm.
   1. משוך את הנוזל לתוך המחט והר זרבובית מזרק (ראה טבלה של חומרים).
   2. הרדמה זבובים עם CO₂ וליישר אותם באזור המיועד שלהם על משטח הזבוב, עם הצד הגחוני למעלה ואת הראשים מכוונים לכיוון החלק הקדמי של כרית. מניחים בקבוקונים באזורים המתאימים על הספסל.
   3. להזריק זבובים בפינה העליונה של הבטן עם 5, 100 ms משאבות של נוזל (~ 10 nL הכולל).
   4. מעבירים את הזבובים המוזרקים לבקבוקונים המתאימים, שימו לב לזמן על הבקבוקון. שמור על 25 °C (69 °F).
2. טען מחט חדשה עם 0.4% פתרון כחול Trypan.
3. הגדר את מזרק פנאומטי GATED, אשר מאפשר זרימה מתמדת של אוויר כדי לדחוף את הנוזל מתוך המחט.
4. יש להרדים זבובים לאחר מנוחה של 30 דקות ולהזריק לטריפאן בלו עד שהבטן מלאה ומנוכה.
   שים לב: כאשר בוחנים התבגרות phagosome עם חלקיקים המסומנים עם צבע רגיש pH, לאפשר זבובים לנוח במשך 1 שעות ולא להזריק עם כחול trypan לפני הרכבה זבובים.
5. הר עף על מגלשות מיקרוסקופ עם סרט חשמלי, צד הגחוני למטה. לדחוף את הכנפיים לצד הזבוב ולאבטח אותם לקלטת. כמו כן, בעדינות לדחוף את הראש לתוך הקלטת כדי להבטיח כי הזבוב לא יזוז.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.