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Encyclopedia of Experiments

成人 果蝇 注射:化合物或标签递送方法

Overview

此视频描述了如何执行活成年苍蝇的注射,并包括一个示例协议,其中标记颗粒和尝试盘蓝色被注射在苍蝇腹部,以检测噬菌体病。

Protocol

本协议摘自纳扎里奥-图尔和吴,评估果蝇的细胞免疫反应, 果蝇,德罗索菲拉梅拉诺加斯特,使用 在Vivo 噬菌体病测定,J.Vis.Exp.(2019 年)。

1. 准备氟西汀颗粒注射

  1. 通过添加 990 μL 无菌 1x PBS 和 10 μL 50 mM 钠 azide,将标有荧光素(见 材料表)的10 毫克市售热杀菌颗粒重组为 10 毫克/mL 的库存浓度。漩涡混合。
    1. 在 0.2 mL 管中分为一次性 8 μL 别名,并存放在 4 °C 的暗箱中,以最大限度地降低与光相关的灵敏度。
      注: 钠 azide 防腐剂是可选的,如果用 1 mL 无菌 1x PBS 制成 1 毫克/毫升库存,则可以省略,并储存在 -20 °C。
  2. 通过混合 500 μL 注射器过滤绿色食品着色和 9.5 mL 无菌 1x PBS,在 1x PBS 中制作 5% 食物着色的 10 mL 解决方案。
  3. 注射前清洗颗粒以去除酸钠。在 1.7 mL 管中混合 42 μL 无菌 1x PBS 和 8 μL 10 毫克/mL。离心机在室温下以最高速度2.5分钟。
    1. 取出超标,加入 50 μL 1x PBS,并在室温下以最大速度离心机 2.5 分钟。
    2. 重复步骤 1.3 和 1.3.1 2 倍,共洗 3 次。
    3. 最后洗涤后,丢弃超自然物,在 1x PBS 中 50 μL 的 5% 食物着色中将颗粒重新悬浮到 1.6 毫克/mL。
    4. 将管子包裹在铝箔中,以防止光线照射。储存在4°C,1周后丢弃。

2. 准备注射站和苍蝇

  1. 准备注射垫。要同时注入多达 4 种类型的苍蝇,请使用实验室胶带将矩形 CO2 飞垫分成 4 个部分。在显微镜附近的长凳上,指定区域放置小瓶,一旦苍蝇被排在垫子上(每个角落一个)。
  2. 准备小瓶的年龄匹配,4-7天大,苍蝇注射。要测试每个菌株,将 5 雄性和 5 个雌性转移到新鲜、标记的准备苍蝇食物小瓶中,并保持在 25 °C。
  3. 准备气动喷油器(见 材料表),将仪器设置为100毫秒(短突发气体压力以排出液体 - 允许交付亚纳米线体积) 定时 模式。
  4. 准备显微镜幻灯片。切开 1.5 英寸的电胶带条,折叠成带胶粘剂侧的循环,并放置在贴有标签的显微镜幻灯片上。

3. 准备玻璃毛细金针

  1. 使用拉针器拉玻璃针(薄壁玻璃毛细。
    1. 用微米在显微镜下握住针头,用细点不锈钢钳子#5断尖。100 μm 提示足以刺穿苍蝇的部位,同时最大限度地减少伤害。
    2. 测量将注入每只苍蝇的液体体积。将针头用无菌的 5% 食物着色剂在 1x PBS 中加载,并将液体排出到 0.01 mm 级微米上的矿物油滴上。
      注:如果液体液滴是球形的,则将象形体中的体积计算为(大小)3/1910。直径为100μm的针头将在100毫秒内喷出~2 nL。

4. 注射苍蝇

  1. 派珀特 10 μL 的 1.6 毫克/mL 颗粒到一个小方形的胶片上。
    1. 将液体拉入针头,放入喷油喷嘴中(参见 材料表)。
    2. 麻醉苍蝇与CO2, 并排队在他们指定的区域在飞垫上,与心室侧向上和头部朝向垫的前面。将小瓶放在长凳上的相应区域。
    3. 在腹部上角注射5,100毫秒的液体泵(总计约10nL)。
    4. 将注射的苍蝇转移到适当的小瓶中,注意小瓶上的时间。保持在25°C。
  2. 用 0.4% 的 Trypan 蓝色解决方案加载新针头。
  3. 将气动喷油器设置为 GATED,使空气不断流动,将液体从针头中推出。
  4. 麻醉苍蝇后,他们已经休息了30分钟,并注入Trypan蓝色,直到腹部饱和扩张。
    注: 当用贴有pH敏感染料标记的颗粒检查噬菌体成熟时,允许苍蝇休息1小时,在安装苍蝇之前不要注射尝试盘蓝色。
  5. 山在显微镜幻灯片上用电胶带飞,心室侧向下。将翅膀推到苍蝇的一侧,并将它们固定在磁带上。此外,轻轻地将头部推入胶带中,以确保苍蝇不会移动。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
5430-10 PicoNozzle Kit World Precision Instruments 5430-10 Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2861 Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 725
Pneumatic PicoPump PV820 World Precision Instruments SYS-PV820 The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections.
The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes.
The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied.
set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW100F-3 Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%) Sigma T8154 Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.

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