Injektion af voksne Drosophila Fluer: En metode til sammensatte eller Label Delivery

Overview

Denne video beskriver, hvordan man udfører en injektion af levende voksne fluer og indeholder et eksempel protokol, hvor mærkede partikler og trypan blå injiceres i flyve maver til assay fagocytose.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Nazario-Toole og Wu, Vurdering af frugtfluens cellulære immunrespons, Drosophila melanogaster, Ved hjælp af en In Vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp. (2019).

1. Forbered fluorescerende partikler til injektion

1. 10 mg kommercielt tilgængelige, varmeaflivede bakteriepartikler mærket med fluorescein (se materialetabel)rekonstrueres til en bestandskoncentration på 10 mg/mL ved at tilsætte 990 μL steril 1x PBS og 10 μL 50 mM natriumanzid. Vortex at blande.
   1. Del i engangsbrug 8 μL aliquots i 0,2 mL rør og opbevares i en mørk kasse ved 4 °C for at minimere lys forbundet følsomhed.
      BEMÆRK: Natriumazidbeskyttelsesmiddel er valgfrit og kan udelades, hvis der fremstilles 10 mg/mL lagre med 1 mL steril 1x PBS, aliquoted og opbevares ved -20 °C.
2. Lav en 10 ml opløsning af 5% fødevarefarve i 1x PBS ved at blande 500 μL sprøjtefiltreret grøn madfarve og 9,5 ml steril 1x PBS.
3. Vask partikler før injektion for at fjerne natrium azide. 42 μL steril 1x PBS og 8 μL på 10 mg/mL blandes i et 1,7 mL rør. Centrifuge ved maksimal hastighed i 2,5 minutter ved stuetemperatur.
   1. Supernatanten fjernes, der tilsættes 50 μL 1x PBS, og centrifuge ved maksimal hastighed i 2,5 min ved stuetemperatur.
   2. Gentag trin 1.3 og 1.3.1 2x, for i alt 3 vaske.
   3. Efter den endelige vask kasseres supernatanten og suspenderes partiklerne igen til 1,6 mg/mL i 50 μL 5% madfarve i 1x PBS.
   4. Wrap røret i aluminiumsfolie for at beskytte mod lys. Opbevares ved 4 °C, kassér efter 1 uge.

2. Forbered injektionsstationen og fluer

1. Gør injektionspuden klar. For at injicere op til 4 genotyper fluer på samme tid skal du bruge laboratorietape til at opdele en rektangulær CO 2-fluepude i 4 sektioner. På bænken nær mikroskopet skal du udpege områder til at placere hætteglassene, når fluerne er blevet linet op på puden (en for hvert hjørne af puden).
2. Forbered hætteglas af aldersmatchede, 4-7 dage gamle, fluer til injektion. For hver stamme, der skal testes, overføres 5 hanner og 5 hunner til et friskt, mærket hætteglas med tilberedt fluefoder og opbevares ved 25 °C.
3. Forbered den pneumatiske injektor (se materialetabel)ved at indstille instrumentet til en 100 ms (korte byger af gastryk for at udvise væsken – så der kan leveres sub-nanolitervolumener) TIMED-tilstand.
4. Forbered mikroskopet dias. Skær 1,5-tommer strimler af elektrisk tape, fold ind i en løkke med den klæbende side ud, og læg på en mærket mikroskop dias.

3. Forbered glas kapillær nåle

1. Træk glasnåle (tynde vægglas kapillærer) ved hjælp af en nål puller.
   1. Hold nålen under mikroskopet med et mikrometer og bryde spidsen ved hjælp af #5 fine punkt rustfrit stål pincet. 100 μm spidser er tilstrækkelige til at gennembore fluens kutikula og samtidig minimere sår.
   2. Mål mængden af væske, der vil blive injiceret i hver flue. Lad nålen med steril 5% mad farve i 1x PBS og udvise væsken på en dråbe mineralsk olie på en 0,01 mm fase mikrometer.
      BEMÆRK: Hvis væskedråben er sfærisk, beregnes volumenet i picoliters som (størrelse)³/1910. En nål med en diameter på 100 μm vil skubbe ~2 nL ud i 100 ms.

4. Injicere fluer

1. Pipetter 10 μL af 1,6 mg/mL partikler på en lille firkant af parafilm.
   1. Træk væsken ind i kanylen og monter i injektordysen (se Materialetabel).
   2. Bedøve fluer med CO₂ og line dem op i deres udpegede område på flypad, med den ventrale side op og hovederne orienteret mod forsiden af puden. Placer hætteglas i tilsvarende områder på bænken.
   3. Injicere fluer i øverste hjørne af maven med 5.100 ms pumper af væske (~ 10 nL i alt).
   4. Overfør de injicerede fluer til de relevante hætteglas, bemærk tiden på hætteglasset. Opbevares ved 25 °C.
2. Lad en ny nål med 0,4% Trypan Blue Solution.
3. Indstil den pneumatiske injektor til GATED, som gør det muligt for en konstant luftstrøm at skubbe væsken ud af nålen.
4. Bedøve fluer, efter at de har hvilet i 30 minutter og injicere med Trypan Blue, indtil maven er fuld og udspilet.
   BEMÆRK: Når man undersøger fagmærket modning med partikler mærket med et pH-følsomt farvestof, skal du lade fluer hvile i 1 time og injicere ikke med trypanblå før montering af fluer.
5. Mount flyver på mikroskop dias med elektrisk tape, ventral side ned. Skub vingerne til siden af fluen og fastgør dem til båndet. Skub også forsigtigt hovedet ind i båndet for at sikre, at fluen ikke bevæger sig.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.