Injektion av vuxna drosophilaflugor: En metod för sammansatt eller etikettleverans

Overview

Denna video beskriver hur man utför en injektion av levande vuxna flugor och innehåller ett exempelprotokoll där märkta partiklar och trypanblått injiceras i flug abdomens för att analysera fagocytos.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Nazario-Toole och Wu, Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp. (2019).

1. Förbered fluoresceinpartiklar för injektion

1. Reconstitute 10 mg kommersiellt tillgängliga, värmedr dödade bakteriepartiklar märkta med fluorescein (se Materialförteckning)till en lagerkoncentration på 10 mg/ml genom att tillsätta 990 μL steril 1x PBS och 10 μL 50 mM natriumazid. Virvel att blanda.
   1. Dela upp 8 μL alikvoter för engångsbruk i 0,2 ml-rör och förvara i en mörk låda vid 4 °C för att minimera ljuskänsligheten.
      OBS: Natriumazidskyddsmedel är valfritt och kan utelämnas om 10 mg/ml-lager är tillverkade med 1 ml sterilt 1x PBS, alikvoterat och förvarat vid -20 °C.
2. Gör en 10 ml lösning på 5% matfärgning i 1x PBS genom att blanda 500 μL spruta filtrerad grön matfärgning och 9,5 ml steril 1x PBS.
3. Tvätta partiklar före injektion för att avlägsna natriumazid. Blanda 42 μL sterilt 1x PBS och 8 μL 10 mg/ml i ett 1,7 ml-rör. Centrifugera vid maxhastighet i 2,5 min vid rumstemperatur.
   1. Ta bort supernatanten, tillsätt 50 μL 1x PBS och centrifugera med maxhastighet i 2,5 min vid rumstemperatur.
   2. Upprepa steg 1.3 och 1.3.1 2x, för totalt 3 tvättar.
   3. Efter den slutliga tvätten, kassera supernatanten och suspendera partiklarna till 1,6 mg/ml i 50 μL 5% matfärgning i 1x PBS.
   4. Linda röret i aluminiumfolie för att skydda mot ljus. Förvara vid 4 °C, kassera efter 1 vecka.

2. Förbered injektionsstationen och flugorna

1. Förbered injektionsdynan. För att injicera upp till 4 genotyper av flugor samtidigt, använd laboratorietejp för att dela en rektangulär CO_2-flugkudde i 4 sektioner. På bänken nära mikroskopet, ange områden för att placera injektionsflaskan när flugor har radats upp på dynan (en för varje hörn av dynan).
2. Förbered injektionsflaska med åldersmatchade, 4-7 dagar gamla, flugor för injektion. För varje stam som ska testas, överför 5 hanar och 5 honor till en färsk, märkt injektionsflaska med beredd flugmat och håll vid 25 °C.
3. Förbered den pneumatiska injektorn (se Materialförteckningen)genom att ställa in instrumentet på 100 ms (korta gastryckssprängningar för att driva ut vätskan – vilket möjliggör leverans av subnanolitervolymer) TIMED-läge.
4. Förbered mikroskopbilderna. Skär 1,5-tums remsor av elektrisk tejp, vik in i en slinga med den självhäftande sidan ut och placera på en märkt mikroskopbild.

3. Förbered glas kapillär nålar

1. Dra glasnålar (tunna väggglas kapillärer) med hjälp av en nåldragare.
   1. Håll nålen under mikroskopet med en mikroskop och bryt spetsen med #5 finpunkts pincett i rostfritt stål. 100 μm spetsar är tillräckliga för att genomborra flugans nagelband samtidigt som sådd minimeras.
   2. Mät volymen vätska som kommer att injiceras i varje fluga. Ladda nålen med steril 5% matfärgning i 1x PBS och utvisa vätskan på en droppe mineralolja på en 0,01 mm stegmikrometer.
      OBS: Om vätskedroppar är sfäriska beräknas volymen i picoliters som (storlek)³/1910. En nål med en diameter på 100 μm skjuter ut ~2 nL i 100 ms.

4. Injicera flugor

1. Pipett 10 μL av 1,6 mg/ml partiklar på en liten kvadrat av parafilm.
   1. Dra vätskan i nålen och montera i injektormunstycket (se Materialförteckning ).
   2. Söva flugor med CO₂ och rada upp dem i deras utsedda område på flypaden, med ventralsidan upp och huvudena riktade mot framsidan av dynan. Placera injektionsflaskan i motsvarande områden på bänken.
   3. Injicera flugor i övre hörnet av buken med 5 100 ms pumpar vätska (~ 10 nL totalt).
   4. Överför de injicerade flugorna till lämpliga injektionsflaska, notera tiden på injektionsflaskan. Håll dig på 25 °C.
2. Ladda en ny nål med 0,4% Trypan Blue Solution.
3. Ställ in den pneumatiska injektorn på GATED, vilket möjliggör ett konstant luftflöde för att trycka ut vätskan ur nålen.
4. Söva flugor efter att de har vilat i 30 min och injicera med Trypan Blue tills buken är full och distended.
   OBS: Vid undersökning av fagosommognad med partiklar märkta med ett pH-känsligt färgämne, låt flugor vila i 1 h och injicera inte med trypanblått innan monteringen flyger.
5. Montera flugor på mikroskoprutschbanor med elektrisk tejp, ventral sida ner. Tryck vingarna åt sidan av flugan och fäst dem på tejpen. Tryck också försiktigt in huvudet i tejpen för att säkerställa att flugan inte rör sig.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.