Drosophila Volwassen hersendissectie: een methode in vliegneurobiologie

Overview

Deze video beschrijft hoe de volwassen Drosophila-hersenen kunnen worden ontleed en geïsoleerd - een procedure die nodig is voor het visualiseren van het orgaan, dat anders wordt verduisterd door de cuticula, het oog en het tracheaweefsel. Het voorbeeldprotocol toont een gedetailleerde demonstratie die hoogwaardige preparaten oplevert die kunnen worden gebruikt voor immunostaining- en beeldvormingsmethoden in de drosophila-neurobiologie.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Kelly et al., Dissectie en Immunofluorescente Kleuring van Mushroom Body en Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).

1. Voorbereiding dissectiestation

1. Plaats de stereomicroscoop en lichtbron met aangesloten glasvezel zwanenhalzen op een groot tafelblad. Om regelmatige handbewegingen te bevorderen en hand "schudden" tijdens het ontleden te verminderen, is het essentieel dat er voldoende hand- en armsteunruimte beschikbaar is rond de microscoop. Zorg ervoor dat er ongeveer 8 - 10 inch aan weerszijden van de microscoop en 4 - 6 inch tussen de basis van de microscoop en de rand van de bank.
2. Vul 2 of 3 putten van een glazen 9-well of 3-well schotel met 1,0 ml PTN buffer (0,1 M Natriumfosfaat buffer pH 7,2, 0,1% nonionische oppervlakteactieve stof, zie Tabel met materialen voor complete buffercomponenten) en plaats naast het ontleedstation op ijs. Nieuw ontlede hersenen worden overgebracht naar deze schaal en opgeslagen tot de fixatiestap.
   OPMERKING: Als live beeldvorming vereist is, moet de dissectiebuffer 1x Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of HL3-buffer zijn. Als intracellulaire eiwitlokalisatie nodig is, kan PBS ook worden gebruikt als een alternatieve buffer voor dissectie en fixatie. Na fixatie moet vervolgens permeabilisatie van celmembranen worden uitgevoerd met PTN-wasbeurten die 0,1% of 0,3% nonionisch reinigingsmiddel bevatten.
   1. Als PBS wordt gebruikt voor dissecties en fixatie, moeten pipetpunten ten minste één keer worden gespoeld met een wasmiddelhoudende buffer (zoals PTN) om te voorkomen dat hersenen tijdens de overdracht naar microcentrifugebuizen aan de plastic pipetpunten blijven plakken.
3. Maak met een lege glazen of plastic petrischaal van 35 mm een dissectieschaal met een siliconen elastomeer. Meng kort de elastomeercomponenten volgens de aanwijzingen van de fabrikant, giet in 35 mm-schalen en laat het 's nachts polymeriseren op een plat oppervlak. Elastomeer dat dissectieschalen bevat, moet worden gebruikt om de fijne uiteinden van de dissectie-tang te beschermen, die gemakkelijk kan worden beschadigd als er contact wordt gemaakt tussen de tang en een harder oppervlak, zoals een glazen schaal. We kopen ook regelmatig in de handel verkrijgde siliconen gecoate gerechten bij online retailers. Om het contrast tijdens dissecties te verhogen, zijn siliconen elastomeer dissectieschalen met inactivated charcoal (en dus zwart gekleurd) bijzonder nuttig.

2. Volwassen hersendissectieprocedure

1. Verdoof 3 - 5 dagen oude volwassen D. melanogaster met CO₂ of door het gebruik van ijs. Als u ijs gebruikt, plaatst u de flacon met vliegen ondersteboven (plug end down) gedurende ~ 5 minuten in een ijsemmer. Door de flacon ondersteboven in ijs te plaatsen, voorkomt u dat vliegen in het voedsel vast komen te zitten. Zodra vliegen zijn verdoofd, plaatst u de vliegen op een koud metalen pad of petrischaaltje in ijs of op een CO 2-uitstotend vliegenkussen. Als hersenen worden ontleed om neurodegeneratie te analyseren, kunnen oudere vliegen ook worden gebruikt.
2. Plaats een kleine hoeveelheid (150 - 200 μL) PTN in het midden van de dissectieschaal met behulp van een transferpipet of een p200 pipet om een "bubbel" van PTN te creëren. Plaats de dissectieschaal onder de stereomicroscoop en stel de belichting en scherpstelling zo in dat de bel van PTN het gezichtsveld vult en gelijkmatig wordt verlicht.
3. Manipuleer vliegen zodat ze "buik omhoog"(d.w.z.ventrale kant omhoog) zijn terwijl ze op het metaal of CO_2-pad liggen.
4. Gebruik een paar #5 tang, pak de buik van een te ontleden vlieg vast en dompel deze, met behoud van de vlieg, volledig onder in de PTN op de dissectieschaal.
   OPMERKING: Voor de rest van het protocol moeten alle stappen worden uitgevoerd terwijl het hoofd is ondergedompeld in PTN.
5. Met behulp van een tweede paar #5 tang, pak de basis van de vlieg proboscis en trek de twee paar tangen uit elkaar om de vliegkop los te maken van het lichaam. Gooi de buik en thorax weg. Tijdens deze stap is het van cruciaal belang dat het hoofd niet wordt vrijgegeven en op het oppervlak van de PTN mag zweven. Zodra het hoofd zweeft, kan het erg moeilijk zijn om weer vast te pakken zonder de hersenen te verpletteren.
   OPMERKING: Met behulp van deze methode worden verbindingen tussen de hersenen en het ventrale zenuwkoord verbroken. Als intacte verbindingen tussen deze gebieden van het CZS vereist zijn, moet een alternatief dissectieprotocol worden gevolgd. Als de proboscis loskomt van de vliegkop voordat de kop wordt verwijderd, zal er een gat zijn waar de proboscis was. Pak in dit geval de vliegkop aan de rand van het gat bij één oog vast. Verwijder vervolgens het hoofd met een matige hoeveelheid kracht terwijl u de twee paar tangen uit elkaar trekt. Af en toe, wanneer het hoofd uit het lichaam wordt verwijderd, blijft het darm- en/of ventrale zenuwkoord aan het hoofd gehecht en moet het worden verwijderd voordat de dissectie wordt voortgezet.
6. Terwijl een tang de proboscis grijpt, moet het tweede paar de mediale rand van het rechtervliegoog grijpen. Trek langzaam de tang uit elkaar. Deze stap moet worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid constante laterale kracht. Terwijl de tang langzaam van elkaar af beweegt, moet de proboscis zich van het hoofd terugtrekken en een centraal gat in de hoofdsparel maken. Gooi de proboscis weg met de eerste tang zonder het mediale gedeelte van het rechteroog los te laten van het tweede paar.
   OPMERKING: Het volwassen D. melanogasterbrein bevindt zich in het caudale(d.w.z.achterste/ achterste) gebied van de vliegkop. Het grijpen van dat gebied van het hoofd moet dus worden vermeden. Idealiter mag alleen het rostrale (d.w.z., voorste) deel van het hoofd in de buurt van het mediale netvlies direct door de tang worden vastgepakt. De hersenen en de bijbehorende luchtpijp moeten nu zichtbaar zijn door het centrale gat in de nagelriem. Op dit moment kunnen alle witte draadjes luchtpijp die uit het gat steken, worden verwijderd en weggegooid.
7. Pak met het tweede paar tangen de mediale rand van het linker netvlies vast (aan de rand van het centrale gat in de hoofdsparel). Om het netvlies en de bijbehorende nagelriem te verwijderen, trekt u de tang langzaam van elkaar af onder een hoek van 180°. Als het netvlies zich dissocieert van de onderliggende optische kwab, moet u een lichte afname van de spanning voelen. Ga langzaam te werk om scheuren van de optische kwab te voorkomen.
   OPMERKING: Het te snel scheiden van de tang tijdens deze stap kan leiden tot het scheuren van de optische kwab of verstoring van de structuren van het paddenstoellichaam. Af en toe wordt de nagelriem verwijderd, maar stukjes van het netvlies blijven aan de optische kwab zitten. Als u de paddestoellichamen in beeld brengen, is het niet volledig nodig om het hele netvlies te verwijderen. Echter, analyse van andere hersengebieden (zoals retinale neuron innervation van de optische hersenlobben) kan vereisen dat het netvlies volledig wordt verwijderd zoals beschreven door.
   OPMERKING: Omdat het netvlies langzaam wordt gescheiden van de onderliggende optische kwab van de hersenen, moet de optische kwab waarneembaar zijn als een ondoorzichtige witte structuur bedekt met witte, stringy luchtpijp. Zodra één netvlies is verwijderd, kan het worden weggegooid. Bij het analyseren van pathfinding van retinale neuronen, moet bijzondere zorg worden besteed tijdens deze stap om schade aan de optische kwab te voorkomen. Een aanvullend protocol gericht op dissectie en live beeldvorming van de fotoreceptorneuronen is ook beschikbaar.
8. Verwijder nu voorzichtig zoveel mogelijk van de zichtbare luchtpijp. De luchtpijp kan al bevatten of later vullen met lucht, waardoor de hersenen zweven en, mogelijk, verloren gaan tijdens latere immunostaining stappen. Om luchtpijp te verwijderen, pluk je het van de hersenen met behulp van een zeer scherp paar #5 tang.
9. Verwijder het resterende netvlies en de omliggende nagelriem door beide paar tangen te gebruiken om het mediale gebied van het linkervliegvlies te grijpen. Scheur het netvlies voorzichtig doormidden om stukjes van het netvlies en de nagelriem te verwijderen. In sommige gevallen blijkt het verwijderen van de resterende nagelriem zonder de hersenen te verpletteren bijzonder uitdagend. In deze gevallen hebben we ontdekt dat de resterende strengen van het ventrale zenuwkoord in plaats daarvan door één paar tangen kunnen worden vastgepakt, terwijl het andere paar tangen wordt gebruikt om de laatste van de nagelriem voorzichtig te verwijderen.
10. Verplaats met behulp van een p200 pipet ontlede hersenen naar een put van de 9- of 3-put schotel met PTN. Hersenen van hetzelfde genotype moeten in dezelfde put worden samengevoegd en op ijs worden gehouden. Hersenweefsel moet binnen een uur na dissectie worden hersteld. Hersenen kunnen in kleine batches worden gefixeerd en samengevoegd als een groter aantal hersenen nodig is. In de meeste gevallen kan een ervaren onderzoeker meestal een brein ontleden en in ongeveer 3 - 5 minuten overbrengen naar de glazen verzamelschaal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
Sylgard dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S-BLK	Available from amazon.com
Na Phosphate Buffer monobasic	Sigma	S3139
Triton X 100	Sigma	X100-100ml
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate)	VWR	89090-482
35mm dish	Genesee Scientific	32-103
Sylgard	Fisher	50-366-794
Kimwipe	Fisher	06-666
PTN Buffer			0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed