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Biology

शीतल Musculoskeletal ऊतकों से स्टेम कोशिकाओं को अलग

doi: 10.3791/2011 Published: July 5, 2010
1,2,3,4, 1, 1,2,3,4,5

Summary

Musculoskeletal मुलायम ऊतकों से अलग वयस्क स्टेम सेल का पालन फ्लास्क करने की गति के आधार पर कोशिकाओं.

Abstract

वयस्क स्टेम कोशिकाओं को लंबे समय से पुनर्योजी चिकित्सा में अपने आवेदन के संबंध में चर्चा किया गया है. वयस्क स्टेम कोशिकाओं उनके प्रभावशाली क्षमताओं के कारण घायल हो गए और रोगग्रस्त ऊतकों के उपचार के लिए बहु - वंश सेल भेदभाव और उनके आत्म नवीकरण क्षमता से गुजरना करने के लिए उत्साह का एक बड़ा सौदा उत्पन्न किया है. सबसे महत्वपूर्ण बात, इन गुणों उन्हें ऑटोलॉगस कोशिका प्रत्यारोपण चिकित्सा में उपयोग के लिए फायदेमंद बना दिया है. वर्तमान प्रोटोकॉल पाठकों को संशोधित preplate तकनीक जहां musculoskeletal प्रणाली है, जैसे पट्टा और मांसपेशियों के कोमल ऊतकों हैं 1 से मिलवा देंगे

Protocol

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सामान्य में, पूरा संशोधित preplate प्रक्रिया की तैयारी के 1-2 दिन, तकनीकी प्रक्रिया के प्रदर्शन के एक सप्ताह, immunocytochemistry के साथ सेल की पहचान के 2-3 दिनों के, और स्टेम सेल की आबादी विस्तार के एक अतिरिक्त 2-3 सप्ताह की आवश्यकता है. स्टेम सेल संस्कृति के लिए आवश्यक उपकरण के लिए इसी तरह की अन्य सेल संस्कृति प्रणालियों की है कि जो एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र, सीओ 2 इनक्यूबेटर, लामिना प्रवाह टिशू कल्चर हुड और एक औंधा प्रतिदीप्ति और एक डिजिटल कैमरा के साथ सुसज्जित खुर्दबीन शामिल हैं. पृथक स्टेम कोशिकाओं को भी और क्लोन किया जा सकता है लंबी अवधि के वर्तमान या भविष्य के अध्ययन 1,2 के लिए तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया जा सकता है. सभी अभिकर्मकों और इस प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल सामग्री बाँझ और aseptically संभाला चाहिए.

चरण 1: तैयारी

  1. कोलेजन कोट टिशू कल्चर व्यंजन और बोतल: प्रकार मैं बछड़ा त्वचा (1 लीटर में 0.1 ग्राम, सिग्मा Aldrich) से व्युत्पन्न कोलेजन. T-25 बोतल, 6 या 12 अच्छी तरह प्लेटें, बर्तन (60 और 100 मिमी, बी.डी. फाल्कन) के रूप में 1,2 पहले वर्णित: कोट करने के लिए plasticware शामिल हैं. धीरे plasticware हर आधे घंटे हिला, 4 घंटे के लिए भी कोलेजन की कोटिंग सुनिश्चित. कोलेजन समाधान तो निकाल दिया जाता है. और लेपित plasticware तो यूवी प्रकाश और दोनों पर हुड के साथ टिशू कल्चर हुड में शुष्क, बाँझपन को सुनिश्चित करने की अनुमति है, और अंत में recapped या बाद में उपयोग के लिए कवर.
  2. ;, 50ml हीट निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय (FBS, Invitrogen) सीरम, 50ml हार्स सीरम (एच एस, Invitrogen), और 5 एमएल चिकी भ्रूण निकालें (CEE, सटीक रासायनिक कं 400ml (Invitrogen DMEM, उच्च ग्लूकोज) DMEM: सेल संस्कृति माध्यम तैयार ) एक डिस्पोजेबल 0.22-सुक्ष्ममापी 500 मिलीलीटर बाँझ फिल्टर प्रणाली (Corning) का उपयोग कर फ़िल्टर वैक्यूम किया जाएगा. बाँझ पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (Invitrogen) अंत में 100 इकाइयों / एमएल जोड़ा जाएगा. कम से कम एक महीने के लिए तैयार समाधान 4 ° C पर संग्रहीत किया जा सकता है. यह समाधान के लिए कुप्पी से कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है बंटवारे संस्कृतियों या प्रत्यारोपण के लिए कक्षों की तैयारी.
  3. सेल अलगाव के समाधान के लिए गर्म निम्नलिखित अभिकर्मकों 37 के लिए गरम हो की आवश्यकता ° सेल अलगाव के लिए उनके उपयोग के लिए पहले सी: हांक buffered नमक (HBSS, Invitrogen) समाधान, 0.2% (wt / खंड) collagenase प्रकार (इलेवन सिग्मा Dispase 2.4 units/1mL (Invitrogen), 0.5% (wt / खंड) trypsin (Invitrogen)) एमएल HBSS प्रति 3,200 कोलेजन पाचन इकाइयों के एक औसत के साथ, Aldrich.
  4. तैयारी में शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित: सर्जिकल प्रक्रिया सहित बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों की आवश्यकता अलग आकार संदंश, सूक्ष्म कैंची, परितारिका कैंची और / या स्केलपेल ब्लेड. 15 इसके अतिरिक्त, और 50 - एमएल polypropylene अपकेंद्रित्र (बी फाल्कन) ट्यूबों, सेल झरनी (ताकना 70 आकार मीटर) (बी फाल्कन), 18 -, 23 - और 27 गेज सुई (बी PrecisionGlide), और 10 - या 20 मिलीलीटर बाँझ सीरिंज (बी).

चरण 2: ऊतक बायोप्सी, अलगाव और यांत्रिक हदबंदी 1-4

ऊतक बायोप्सी एक बाँझ संस्कृति हुड के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं और हौसले से काटा tendons और कंकाल की मांसपेशियों में शामिल हैं जंगली प्रकार चूहों के hindlimb (स्त्री C57BL/6J, उम्र के 4-5 सप्ताह या छोटी जैक्सन, टिबिअ या soleus मांसपेशियों से प्राप्त कर रहे हैं प्रयोगशाला). कोई दिखाई संयोजी ऊतक, रक्त वाहिकाओं, और वसा ऊतकों फिर बायोप्सी नमूनों से हटा रहे हैं. कण्डरा और मांसपेशियों के ऊतकों को तो ध्यान से एक शल्य विदारक करने के लिए त्वचा और हड्डी के अवशेष को हटाने खुर्दबीन के तहत की पहचान और ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) HBSS (FBS के 5% जोड़ने के साथ पूरक). युक्त डिश में रखा पृथक ऊतकों तो अलग कोलेजन लेपित ठंड HBSS युक्त बर्तन पर रखा और (<1x1 3 मिमी) एक मोटे सूक्ष्म कैंची और / या स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर घोल में कीमा बनाया हुआ होगा.

चरण 3: ऊतकों के enzymatic पाचन:

कीमा बनाया हुआ ऊतक तो 2,4,5 कदम की एक श्रृंखला के माध्यम से enzymatically dissociated

  1. अलग 15 मिलीलीटर ट्यूबों और ~ 3500 rpm पर 4 पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस के लिए 5 मिनट में कीमा बनाया हुआ ऊतक slurries स्थानांतरण.
  2. सतह पर तैरनेवाला निकालें, HBSS के साथ धोने और centrifugation फिर से दोहराने.
  3. सतह पर तैरनेवाला निकालें, और prewarmed 0.2% collagenase प्रकार इलेवन (सिग्मा) के 10 मिलीलीटर जोड़कर इन slurries को पचाने में. 37 पर 60 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस जबकि लगातार धीरे ट्यूब कमाल की है. वैकल्पिक रूप से, हाथ से हर 10 मिनट हिला.
  4. अपकेंद्रित्र और 10 मिलीलीटर (2.4 इकाइयों / एमएल, Gibco) dispase समाधान में इन slurries resuspend. 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए सेते हैं, हाथों के साथ मिलाते हुए या धीरे से हर 10 मिनट का घोड़ा.
  5. अपकेंद्रित्र और फिर निलंबित 0.2% trypsin HBSS समाधान के 10 मिलीलीटर में इन slurries. ऊष्मायन हद तक जो एकल कक्षों है जो माइक्रोस्कोप के अंतर्गत निलंबन देख द्वारा किया जा सकता ऊतकों से रिहा कर रहे हैं के आधार पर अलग अलग होंगे. यह 37 पर 30 मिनट से अधिक नहीं की सिफारिश ° inverting ट्यूबों के साथ सी या धीरे से हर 10 मिनट का घोड़ा.
  6. परिणामस्वरूप सेल अपकेंद्रित्रs और फिर से निलंबित प्रसार मध्यम (प्रधानमंत्री) के 10 मिलीलीटर में सेल गोली.
  7. सुइयों की एक श्रृंखला के माध्यम से निकालने से गुजर रहा सेल निलंबन को अलग कर देना. कोशिकाओं तो एक 18G के माध्यम से 2 बार पारित कर दिया, तो एक 23g, और अंत में एक 27G सुई.
  8. एक सेल 70 सुक्ष्ममापी झरनी के माध्यम से सेल निकालने दर्रा.

चरण 4: के लिए अलग सेल कोशिका आसंजन दर 1-3 पर आधारित आबादी को अलग Preplating

  1. अपकेंद्रित्र और प्रसार मध्यम में सेल छर्रों resuspend.
  2. प्लेट एक कोलेजन लेपित फ्लास्क टी 25 (या 60 मिमी पकवान) पर सेल मिश्रण और यह PP1 के रूप में चिह्नित. सेल निलंबन खुर्दबीन के नीचे अपवर्तक नाभिक और अन्य मलबे का बड़ी संख्या में रखने के रूप में मनाया जाना चाहिए.
  3. 37 में सेते ° सी एक humidified, 5% सीओ 2 घंटे के लिए 2 इनक्यूबेटर में.
  4. एक नए कोलेजन लेपित PP2 के रूप में टी - 25 (या 60 मिमी पकवान) फ्लास्क और निशान है nonadherent कोशिकाओं स्थानांतरण. PP1 लेबल थाली में प्रधानमंत्री के 5 मिलीलीटर जोड़ें. जल्दी पालन कोशिकाओं जो फ्लास्क को देते हैं ज्यादातर 3 myofibroblasts.
  5. एक और 24 घंटे के लिए, इनक्यूबेटर करने के लिए बोतल लौटें एक नई टी 25 फ्लास्क कोलेजन लेपित (या पकवान) nonadherent कोशिकाओं हस्तांतरण और यह PP3 के रूप में चिह्नित. PP2 लेबल थाली में प्रसार मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें. इन पालन कोशिकाओं जो इस फ्लास्क के लिए देते हैं ज्यादातर 2,3 fibroblasts.
  6. इनक्यूबेटर करने के लिए बोतल वापसी और अगले 24 घंटे में प्रक्रिया दोहराएँ जब तक जनसंख्या PP6 बनाया है. निलंबित कोशिकाओं के प्रत्येक समूह को बनाए रखने और उन्हें अनुमति को पैदा करना और उन्हें नियमित रूप से जांच एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग. PP3 - PP4 ज्यादातर myoblasts जबकि मांसपेशियों उपग्रह कोशिकाओं अक्सर 2 PP5 में ज्यादातर देखा.
  7. धीरे पालन कोशिकाओं के अधिकांश आम तौर पर PP6 द्वारा देते हैं. इस स्तर पर, छोटे, गोल, प्रकाश अपवर्तक कोशिकाओं दिखाई देते हैं और संख्या में बहुत विरल हैं और एक स्टेम सेल की आबादी 1,2 माना जाता है.

चरण 5: पहचान और पृथक स्टेम कोशिकाओं का विस्तार

  1. पृथक PP6 कोशिकाओं की संख्या में बहुत कुछ कर रहे हैं और FBS अमीर प्रसार (20% DMEM में FBS) मध्यम है कि दैनिक बदल जाता है में रखा जाना चाहिए. कोशिकाओं के अधिकांश संवर्धन के निम्नलिखित 1-2 हफ्तों के दौरान PP6 संस्कृति मरने में मौजूद है, लेकिन एक बड़े, स्वस्थ जनसंख्या PP6 आमतौर पर विस्तार का एक अतिरिक्त 1-2 सप्ताह के बाद बनाई गई है. स्टेम कोशिकाओं को चूहों से अलग अत्यधिक स्टेम कोशिका प्रतिजन 1 (Sca1), CD34, भ्रूण जिगर 1 kinase (Flk1), और अन्य स्टेम 1,2,6,7 मार्करों जो immunocytochemical धुंधला हो जाना के माध्यम से visualized किया जा सकता है व्यक्त करते हैं. इन स्टेम कोशिकाओं को भी कई भेदभाव क्षमताओं प्रदर्शन 3,6,8.
  2. अलग कक्षों को बनाए रखा और संस्कृति में एक कम घनत्व सेल में विस्तार (5-10 कोशिकाओं में 12 अच्छी तरह से बर्तन / अच्छी तरह से या <फ्लास्क या डिश में 20-30% संगम) के भेदभाव 1,2 से बचने के. विस्तार के दौरान बहुत कुछ कोशिकाओं क्लोन फार्म, और इन क्लोन स्टेम कोशिकाओं को किसी अन्य क्षमता के अध्ययन के लिए लंबे समय से प्रसार (LTP) से गुजरना कर सकते हैं. क्लोन स्टेम कोशिकाओं को भी सामान्य सेल का भंडारण प्रक्रियाओं का उपयोग करते हुए तरल नाइट्रोजन में दुकान हो सकता है 10% DMSO के साथ PM मध्यम जैसे कर सकते हैं. किसी अन्य पीठ अप अध्ययन के लिए स्टेम कोशिकाओं के कम बीतने के शेयरों की संख्या बनाओ.

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Discussion

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यह स्वीकार किया गया है कि कुछ वयस्क ऊतकों एकाधिक स्टेम कोशिकाओं होते. अध्ययन के पिछले कुछ वर्षों में स्टेम कोशिकाओं के कंकाल की मांसपेशी और कण्डरा सहित नरम musculoskeletal ऊतकों में पाया गया है. यह वर्तमान प्रोटोकॉल एक प्रक्रिया के विवरण, संशोधित preplate तकनीक है कि सफलतापूर्वक किया गया है करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता tendons और कंकाल की मांसपेशी से वयस्क स्टेम सेल को अलग रूप में जाना जाता है. संशोधित preplate कोशिकाओं के ऊपर वर्णित तकनीक का उपयोग कई कोलेजन लेपित बोतल (चित्रा 1) के लिए अपने आसंजन विशेषताओं के आधार पर आबादी में विभाजित किया जा सकता है है. Fibroblasts और ऊतकों के भीतर पाया myofibroblasts जल्दी से 24-48 घंटे के भीतर कोलेजन लेपित बोतल का पालन कर रहे हैं और शुरू में PP1 - PP2 में अन्य कोशिकाओं से अलग हैं. myogenic या endothelial कोशिकाओं 48-96 घंटे के भीतर एक लंबी समय अवधि (PP3 PP5) के बाद कोलेजन लेपित बोतल का पालन, और काटा जा सकता है और उनके कोशिका की सतह मार्करों द्वारा की पहचान की. बाद में preplated कोशिकाओं, 96 घंटे या बाद में (PP6), वयस्क स्टेम सेल (चित्रा 2) के रूप में माना जाता है. देर preplate कोशिकाओं छोटे, गोल, और उनके अलगाव की शुरुआत में पारदर्शी दिखाई देते हैं और आगे या स्टेम सेल 1 प्रतिजन (Sca1), CD34, भ्रूण जिगर 1 kinase (Flk1) की उनकी अभिव्यक्ति के लिए प्रवाह cytometry immunocytochemistry द्वारा विशेषता कर सकते हैं, और अन्य स्टेम सेल मार्कर (चित्रा 3). पृथक स्टेम कोशिकाओं आत्म नवीकरण और प्रायोगिक अध्ययन के लिए क्षमता उनके भेदभाव के माध्यम से तीन रोगाणु परतों में उनके multipotency प्रदर्शन किया है: mesoderm, बाह्य त्वक स्तर, और 9 endoderm. एकाधिक जांच से यह भी पता चला है कि इन स्टेम कोशिकाओं mesoderm वंश के osteocytes, adipocytes, chondrocytes, और hematopoietic कोशिकाओं 6,8 सहित कोशिकाओं में अंतर है. अन्य अध्ययनों से दिखा दिया है कि वयस्क स्टेम सेल neuronal और glial सेल मार्कर और उनके अंग समारोह में सुधार के बाद 10 परिधीय तंत्रिका क्षतिग्रस्त हो गया है की क्षमता उनकी अभिव्यक्ति के माध्यम से बाह्य त्वक स्तर सेल प्रजातियों में अंतर है. ये पृथक वयस्क स्टेम सेल घायल हो गए और musculoskeletal रोगग्रस्त ऊतकों की मरम्मत के लिए फायदेमंद किया गया है, और vivo अध्ययन में संबंधित अन्य हृदय, जिगर, और रीढ़ की हड्डी के रूप में अच्छी तरह के रूप में विशिष्ट छोटे आंतों submucosa और इलाज मूत्राशय की तरह चिकित्सा शर्तों सहित अन्य ऊतकों पर प्रदर्शन किया गया है तनाव मूत्र असंयम 9.

चित्रा 1
चित्रा 1.

चित्रा 2
चित्रा 2.

चित्रा 3
चित्रा 3.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen #11995-073
FBS Invitrogen #10437-028
Heat-inactivated horse serum Invitrogen #26050-088
Chick embryo extract Accurate Chemical #CE650T-10
100U ml penicillin/streptomycin Invitrogen #15140-122
Dulbecco's PBS Invitrogen #14190-250
Hank's Buffered Salt Solution Invitrogen #24020-117
Collagenase type XI 0.2%(wt/vol) Sigma-Aldrich #C7657
Dispase2.4U ml Invitrogen #17105-041
Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250) Invitrogen #15400-054
Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter Sigma-Aldrich #C-9791
DMSO Sigma #D-2650

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References

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Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011, doi:10.3791/2011 (2010).More

Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011, doi:10.3791/2011 (2010).

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