Summary
Células adultas isolando-tronco de tecidos moles músculo-esqueléticas com base na velocidade da célula a adesão ao frasco.
Abstract
Células-tronco adultas têm sido discutidas em relação à sua aplicação na medicina regenerativa. Células-tronco adultas têm gerado uma grande emoção para o tratamento de tecidos lesionados e doentes, devido à sua capacidade impressionante de se submeter multi-linhagem diferenciação celular e sua capacidade de auto-renovação. Mais importante ainda, essas qualidades fizeram-lhes vantajoso para uso em terapias de transplante autólogo de células. O protocolo atual irá introduzir os leitores à técnica preplate modificado onde os tecidos moles do sistema músculo-esquelético, por exemplo, tendão e músculo, são um
Protocol
Em geral, o procedimento completo preplate modificada exige 1-2 dias de preparação, uma semana de realizar o procedimento técnico, 2-3 dias de identificação de células com imunocitoquímica, e um adicional de 2-3 semanas de tronco expansão da população celular. Os equipamentos necessários para a cultura de células-tronco são semelhantes ao de sistemas de célula de outra cultura, que inclui uma Centrífuga de bancada, incubadora de CO 2, câmara de fluxo laminar de cultura de tecidos e um microscópio invertido equipado com fluorescência e uma câmera digital. As células-tronco isoladas também podem ser clonados e pode ser armazenado a longo prazo em nitrogênio líquido para os 1,2 estudos atuais ou futuras. Todos os reagentes e materiais utilizados para este procedimento deve ser estéril e manuseados assepticamente.
Etapa 1: Preparação
- Colágeno casaco pratos de cultura de tecidos e frascos: colágeno tipo I derivado do bezerro de pele (0,1 g em 1 litro; Sigma-Aldrich). O plasticware para revestir inclui: T-25 frascos, 6 ou 12 pratos bem, pratos (60 e 100 mm, BD Falcon) como descrito anteriormente 1,2. Agite suavemente o plasticware cada meia hora, durante 4 horas para garantir até mesmo revestimento do colágeno. A solução de colágeno é então removido. E o plasticware revestido é então deixada para secar na capa de cultura de tecidos com a luz UV eo capô tanto, para garantir a esterilidade e, finalmente, recapeadas ou cobertas para uso posterior.
- Prepare meio de cultura celular: 400mL DMEM (DMEM, glicose alta, Invitrogen), 50 ml de calor de soro fetal bovino inativado (FBS, Invitrogen), 50 ml soro de cavalo (HS, Invitrogen), e 5 mL Extrato de embrião de galinha (CEE; Accurate Chemical Co. ) será filtrada a vácuo através de um descartáveis 0,22 M-500-ml sistema de filtro estéril (Corning). Estéril de penicilina / estreptomicina solução (Invitrogen) será adicionado finalmente 100 Unidades / mL. As soluções preparadas podem ser armazenadas a 4 ° C durante pelo menos um mês. Esta solução é usada para separar as células do frasco quando as culturas divisão ou preparar as células para transplante.
- Warm up soluções para isolamento de células: Os reagentes a seguir precisam ser aquecidos a 37 ° C antes da sua utilização para o isolamento de células: Solução de Hank Sal Buffered (HBSS, Invitrogen); 0,2% (wt / vol) colagenase do tipo XI (Sigma -Aldrich), com uma média de 3.200 unidades de digestão de colágeno por mL HBSS; Dispase 2,4 units/1mL (Invitrogen), 0,5% (wt / vol) de tripsina (Invitrogen).
- Esterilizar equipamentos cirúrgicos em preparação: O procedimento cirúrgico requer instrumentos cirúrgicos estéreis, incluindo: diferentes tamanhos fórceps, micro-tesouras, tesoura de íris e / ou lâminas de bisturi. Além disso, 15 e 50 mL tubos de polipropileno de centrifugação (BD Falcon); filtro Cell (tamanho dos poros 70 m) (BD Falcon); 18 -, 23 - e 27-gauge agulha (BD PrecisionGild) e 10 - ou 20 ml seringas esterilizadas (BD).
Passo 2: biópsias de tecidos, isolamento e dissociação mecânica 04/01
As biópsias de tecido são realizados sob uma capa de cultura estéreis e incluem recém-colhidas tendões e músculos esqueléticos são obtidos a partir dos músculos sóleo tíbia ou do membro posterior de camundongos selvagens (C57BL/6J Feminino, 4-5 semanas de idade ou mais jovens, Jackson laboratório). Qualquer tecido conjuntivo visíveis, vasos sanguíneos e tecido adiposo são então removidas das amostras de biópsia. Os tecidos de tendão e músculo são, então, cuidadosamente identificados sob um microscópio cirúrgico de dissecação para remover restos de pele e osso e colocada em um prato contendo frio (4 ° C) HBSS (suplementado com acrescentar 5% de FBS). Os tecidos isolados são então colocados separadamente em pratos de colágeno revestido contendo HBSS frio e será picada (<milímetros 1x1 3) em uma pasta grossa usando micro-tesoura e / ou lâminas de bisturi.
Passo 3: A digestão enzimática dos tecidos:
O tecido é então enzimaticamente picada dissociado através de uma série de passos 2,4,5
- Transferência de suspensões de tecido picada em separado, 15 ml tubos e centrifugar a 3.500 rpm ~ a 4 ° C por 5 minutos.
- Remover o sobrenadante, lavar com HBSS e repita a centrifugação novamente.
- Remover o sobrenadante, e digerir essas pastas, adicionando 10 ml de pré-aquecida 0,2% de colagenase tipo XI (Sigma). Incubar por 60 minutos a 37 ° C, enquanto continuamente balançando suavemente os tubos. Alternativamente, agitar a mão a cada 10 minutos.
- Centrifugar e ressuspender essas suspensões em 10 ml dispase (2,4 Unidades / mL, Gibco) solução. Incubar por 45 minutos a 37 ° C, agitando delicadamente com as mãos ou balançar a cada 10 minutos.
- Centrífuga e re-suspender estas lamas em 10 ml de solução de tripsina 0,2% HBSS. De incubação varia de acordo com a medida em que as células individuais são liberados a partir de tecidos que podem ser realizados através da observação da suspensão ao microscópio. Não é recomendável ultrapassar 30 minutos a 37 ° C com invertendo os tubos ou balançando suavemente a cada 10 minutos.
- Centrífuga da célula, resultandos e re-suspender o pellet celular em 10 ml de Proliferação Médio (PM).
- Dissociar a suspensão de células, passando o extrato através de uma série de agulhas. As células são então passadas duas vezes através de um 18G, em seguida, uma 23G e, finalmente, uma agulha 27G.
- Passe o extrato celular através de um filtro de células 70 mícrons.
Passo 4: Preplating para isolar populações de células diferentes com base em taxa de adesão celular 03/01
- Centrifugar e ressuspender o pellets de células em meio de proliferação.
- Misturas placa da célula em um colágeno revestido frasco T-25 (ou 60 prato mm) e marcá-la como PP1. A suspensão de células devem ser observados como possuindo um grande número de núcleos de refração e outros detritos sob o microscópio.
- Incubar a 37 ° C em um umidificado, 5% incubadora de CO 2 por 2 horas.
- Transferência de células não-aderentes a um novo colágeno revestido T-25 frasco (ou 60 prato mm) e marcar é tão PP2. Adicionar 5 ml da PM na placa rotulados PP1. As células iniciais aderindo, que atribuem ao balão são na sua maioria miofibroblastos 3.
- Devolver os frascos para a incubadora por mais 24 horas, a transferência de células não-aderentes a um novo colágeno revestido T-25 frasco (ou prato) e marcá-la como PP3. Adicionar 5 ml de meio de proliferação na placa rotulados PP2. Estas células aderentes, que atribuem a este frasco são principalmente fibroblastos 2,3.
- Frascos de retorno para a incubadora e repita o procedimento em mais 24 horas até PP6 população é criada. Manter cada grupo de células em suspensão e permitir que eles se proliferam e examiná-los regularmente usando um microscópio invertido. PP3 PP4-são principalmente os mioblastos, enquanto as células musculares satélite são muitas vezes vistos principalmente no PP5 2.
- A maioria das células lentamente aderindo tipicamente anexar por PP6. Nesta fase, as células parecem pequenos, refração, redondos de luz e são muito escassos em número e são considerados uma haste 1,2 população celular.
Passo 5: Identificação e expansão de células-tronco isoladas
- O isolado PP6 células são muito poucos em número e precisam ser mantidos em meio de proliferação FBS ricos (20% FBS em DMEM), que é trocada diariamente. A maioria das células presentes na cultura PP6 morrer durante os seguintes 1-2 semanas de cultivo, mas um grande PP6 população saudável é geralmente criado após um adicional de 1-2 semanas de expansão. As células-tronco isoladas de camundongos altamente expressar antígenos de células-tronco 1 (SCA1), CD34, quinase fígado fetal 1 (Flk1), e marcadores-tronco outros 1,2,6,7 que pode ser visualizado através de coloração imuno-histoquímico. Essas células-tronco também apresentam capacidades de diferenciação múltiplas 3,6,8.
- As células isoladas são mantidas e expandidas com uma densidade baixa de células em cultura (12-bem pratos a 50-100 células / poço ou <confluência de 20-30% no frasco ou prato) para evitar 1,2 diferenciação. Muito poucas células, formam clones durante a expansão, e essas células-tronco clonadas podem sofrer proliferação tempo (LTP) para quaisquer estudos competência outros. As células-tronco também podem ser clonados loja em nitrogênio líquido através de procedimentos gerais de armazenamento de células p.ex PM com DMSO 10%. Fazer uma série de unidades populacionais de baixa passagem das células-tronco para os estudos de outros para trás.
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Discussion
Foi reconhecido que alguns tecidos adultos contêm células-tronco múltiplas. Ao longo dos últimos anos de estudo, células-tronco têm sido detectadas nos tecidos moles músculo-esqueléticas, incluindo o músculo esquelético e tendão. Este protocolo atual detalhes de um procedimento, conhecido como a técnica preplate modificado, que tem sido utilizado com sucesso em nosso laboratório para isolar células-tronco adultas a partir de tendões e músculo esquelético. Usando a técnica preplate modificado descrito acima as células podem ser divididos em várias populações com base em suas características de adesão ao frascos colágeno revestido (Figura 1). Fibroblastos e miofibroblastos encontrados dentro dos tecidos rapidamente aderem ao colágeno revestido frascos dentro de 24-48 horas e são inicialmente separadas de outras células no PP1-PP2. As células endoteliais miogênica ou aderir a frascos de colágeno revestido após um período de tempo, dentro de 48-96 horas (PP3-PP5), e podem ser colhidas e identificadas por seus marcadores de superfície celular. As células mais tarde preplated, 96 horas ou mais tarde (PP6), são considerados como células-tronco adultas (Figura 2). As células preplate tarde aparecem pequenas, redondas, e translúcida no início de seu isolamento e pode ser ainda caracterizada por citometria de fluxo ou imunocitoquímica para a sua expressão de antígeno de células-tronco 1 (SCA1), CD34, quinase fígado fetal 1 (Flk1), e marcadores de células-tronco outros (Figura 3). As células-tronco isoladas têm a capacidade de auto-renovação e estudos experimentais têm demonstrado a sua multipotency através de sua diferenciação em três camadas germinativas: mesoderma, ectoderma e endoderma 9. Múltiplas investigações revelaram também que essas células-tronco se diferenciarem em células da linhagem mesoderma incluindo osteócitos, adipócitos, condrócitos e células hematopoéticas 6,8. Outros estudos demonstraram que as células-tronco adultas se diferenciar em linhagens celulares ectoderma através de sua expressão de marcadores de células neuronais e gliais e sua capacidade de melhorar a função do membro após o nervo periférico foi danificado 10. Essas células-tronco adultas isoladas foram benéficos para a reparação de feridos e doentes tecidos músculo-esqueléticos, e outros relacionados com estudos in vivo foram realizados em outros tecidos, incluindo coração, fígado e medula espinhal, assim como condições médicas específicas, como submucosa do intestino delgado e bexiga para tratar incontinência urinária de esforço 9.
Figura 1.
Figura 2.
Figura 3.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores são muito satisfeito com a Sra. Haiying Pan e Ian Mr. Bellayr por sua ajuda técnica sobre o isolamento de células para os filmes atuais e Kyle Sr. Holden eo Sr. Jonathan Lucas pela ajuda na edição de slide. Muito obrigado a seguinte lista de pessoas que estiveram envolvidas com o desenvolvimento das técnicas preplate modificado ao longo dos últimos anos: os drs. Burhan Gharaibeh, Baohong Cao, Deasy Bridget, Thomas R. Payne, Aiping Lu, Hairong Peng, Hideki Oshima, Bo Zeng, Xiaodong Mu, KIMIMASA Tobita, Ron Jankowski, Makato Ikezawa. Estamos gratos pela assistência técnica de James H. Cummins, Pruchnic Ryan, Feduska Joseph, C. Rebecca Schugar, Pan Haiying e Tebbets Jessica. O autor também gostaria de agradecer o apoio financeiro para este trabalho a partir da Muscular Dystrophy Association (MDA), o National Institutes of Health (NIH), o Departamento de Defesa (DOD), Hospital Infantil de Pittsburgh de UPMC, o Departamento de Cirurgia Ortopédica, e da Universidade de Pittsburgh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11995-073 | |
| FBS | Invitrogen | #10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | #26050-088 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | #CE650T-10 | |
| 100U ml penicillin/streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | #14190-250 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Invitrogen | #24020-117 | |
| Collagenase type XI 0.2%(wt/vol) | Sigma-Aldrich | #C7657 | |
| Dispase2.4U ml | Invitrogen | #17105-041 | |
| Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250) | Invitrogen | #15400-054 | |
| Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter | Sigma-Aldrich | #C-9791 | |
| DMSO | Sigma | #D-2650 |
References
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