Summary
我々は細胞の曲げ剛性を測定するために光トラップを使用して、カバースリップの表面に付着する糸状菌細胞を曲げるためのプロトコルを提示する。
Abstract
我々は、糸状棒状の細菌の曲げ剛性を測定するためのプロトコルを開発した。力は光トラップ、高強度レーザービームを顕微鏡の対物レンズによって非常に小さなスポットに焦点を当てているときに形成される光で作られた微細な三次元の春に適用されます。セルを曲げることは、まず化学的に処理されたカバースリップに生菌をバインドします。これらの細胞が成長するにつれ、細胞の真ん中には、カバースリップに結合したままですが、成長末端はこの拘束は無料です。薬セファレキシンと糸状成長を誘導することによって、我々は、もう一方の端がアタッチされていないと曲げ力の影響を受けやすいままであったセルの一端が表面に付着された細胞を同定することができます。曲げ力は、増殖細胞の先端にポリリジンでコーティングされたビーズを結合することによって、光学トラップで適用されます。力とビーズの変位の両方を記録し、細胞の曲げ剛性は、この関係の傾きであるされています。
Protocol
- 指数増殖期（OD = 0.2〜0.4）へのルリア - Beltraniブイヨン（LB）培地で大腸菌の細胞を成長する。
- 15分糸状成長を誘導し、遠心分離によって5回で文化を集中させるためのセファレキシンの50μg/ mLのを補充したLBの文化を成長する。
- フローチャンバーに水で希釈した1％のポリエチレンイミンを流すことによりPEIでコーティングされたカバースリップを作り、5分間のインキュベーション後、水で洗ってください。
- チャンバー内に濃縮された細胞培養を流れる、と結合されていない細胞を除去するために3分後にLBとセファレキシン（50μg/mL）の混合物で洗浄した。
- 37室のインキュベート° Cは、添付細胞が光トラッピング装置での配置の前に成長させること30分、1時間。
- 30分間水で希釈した0.1％ポリリジンで0.5μmの直径のポリスチレンビーズ（前髪ラボ）をインキュベートすることにより、ポリリジンでコーティングされたビーズを加えます。その後、ビーズを3回洗浄し、水に懸濁します。
- セファレキシン（50μg/mL）を含むLBに2つの要因によってビーズ溶液を希釈し、そしてフローチャンバーにそれを追加します。
- 光学的にフローティングビーズをトラップし、細胞の自由な先端に触れる。 （我々は、サンプルの動きを制御するマッドシティLabsのピエゾステージを使用する。）適当なセル/ビーズの組み合わせが見つかると、アタッチされていないビーズを除去するLBのセファレキシン（50μg/mL）でチャンバーを洗浄する。
- セルと記録力 - 変位のデータに曲げ力を適用するためにカスタムで作成されたLabVIEWプログラムを実行します。プログラムの詳細
- ラスタが検出レーザービームと記録3D PSDの電圧信号内に添付されたビーズを走査することにより、検出器の応答を較正します。
- 顕微鏡画像の細胞長軸を識別します。
- 細胞長軸に垂直な方向のステップでセルを移動します。
- 光トラップからの距離を移動し、変位を記録。
- 以前に測定されたトラップの剛性を使用して加えられる力に変位に変換し、ファイルへの先端の変位と力を保存します。
成功の秘訣：ステップ8で）、一つは、明確に定義されたスタックの端でセルを見つける必要があります。いくつかのセルは、一つの先端で立ち往生、および他の先端の曲げ力は、旋回ではなく、曲げ細胞全体につながるされています。適切なペアは、ジョイスティック制御の段階の動きを使って手作業で迅速に各セルを曲げることにより求められる。
代表的な結果：
図1この図は、単一のセルのための力-変位のデータを示しています。この直線の傾きは、セルの曲げ剛性である。
Discussion
ここで紹介するプロトコールは、定量的に細菌細胞の曲げ特性を測定するために設計されています。実験のセットアップはfilamentously成長させることができる任意の棒状体細胞に適用することができます。我々は成功したE.の曲げ剛性の細胞骨格フィラメントの影響を調べるためにこの設定を使用している大腸菌細胞。この同じ手法は、細胞の全体的な曲げ剛性を決定する際の圧力、細胞壁の剛性と他の細胞内成分の役割を評価するために使用することができます。
Disclosures
この記事のビデオ制作は、これらの研究で使用される楽器を作り出すマッドシティ研究所後援した。
Acknowledgments
我々は、表面への結合細胞に宅太陽から有用なアドバイスを認めます。我々は、貴重な議論のためにネッドウィングリーンとZemer Gitaiに感謝。この研究は、厚生助成金P50GM07150、国立科学財団のキャリア賞PHY - 0844466とアルフレッドP.スローン財団の国立研究所によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895-5G | |
| polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 181978-5G | |
| polylysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 0.5-μm-diameter polystyrene beads | Bangs Laboratories | PS03N | |
| Nano-LP Series nanopositioning system | Mad City Labs | NanoLP series | http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html |
References
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).
