Summary
Nous présentons un protocole pour le pliage des cellules bactériennes filamenteuses attaché à une surface lamelle avec un piège optique pour mesurer la rigidité de flexion cellulaires.
Abstract
Nous avons développé un protocole pour mesurer la rigidité de flexion de filamenteuse en forme de bâtonnets. Les forces sont appliquées avec un piège optique, un microscope en trois dimensions du printemps fait de lumière qui se forme quand un faisceau de haute intensité laser est focalisé sur un très petit point par une lentille de l'objectif du microscope. Pour courber une cellule, nous avons d'abord se lier aux bactéries vivantes d'une lamelle traitée chimiquement. Comme ces cellules se développent, au milieu des cellules est liée à la lamelle, mais les extrémités sont libres de plus en plus de cette contrainte. En induisant la croissance filamenteuse avec la céphalexine drogue, nous sommes en mesure d'identifier les cellules dans laquelle une extrémité de la cellule a été collé à la surface tandis que l'autre extrémité est restée seules et sensibles aux forces de flexion. A force de flexion est ensuite appliqué avec un piège optique en se liant d'un cordon polylysine enduits à la pointe d'une cellule en croissance. La fois la force et le déplacement de la bille sont enregistrées et la rigidité en flexion de la cellule est la pente de cette relation.
Protocol
- Cultiver des cellules de E. coli dans Luria-Beltrani bouillon (LB) à la phase exponentielle (DO = 0,2-0,4).
- Cultiver la culture en milieu LB supplémenté avec 50 ug / ml de céphalexine pendant 15 min pour induire la croissance filamenteuse, et ensuite se concentrer à la culture de 5 fois par centrifugation.
- Faire PEI enduit de lamelle en s'écoulant polyéthylènimine 1% dilué dans de l'eau dans une chambre de flux, et laver avec de l'eau après une incubation de 5 minutes.
- Débit de la culture de cellules concentrées dans la chambre, et on les lave avec un mélange de LB et céphalexine (50μg/mL) après 3 min pour éliminer les cellules seules.
- Incuber la chambre à 37 ° C pendant 30 min-1 heure pour laisser les cellules attachées croître avant le placement sur l'instrument piégeage optique.
- Faire polylysine billes recouvertes par l'incubation des billes de polystyrène de 0,5 um de diamètre (Bangs Labs) dans la polylysine 0,1% dilué dans l'eau pendant 30 min. Puis laver les billes de 3 fois et remettre en suspension dans l'eau.
- Diluer la solution bourrelet par un facteur de deux dans la LB avec céphalexine (50μg/mL), et l'ajouter dans la chambre de flux.
- Optiquement piéger un flottant de perles et le toucher à l'extrémité libre d'une cellule. (Nous utilisons un Mad Labs Ville piézo scène pour le contrôle du mouvement de l'échantillon.) Quand une combinaison appropriée billes / cellule est trouvée, laver la chambre avec céphalexine dans LB (50μg/mL) pour enlever les perles seules.
- Exécutez le programme personnalisé écrite LabView pour appliquer des forces de flexion à la cellule et d'enregistrer force-déplacement de données. Détails du programme
- Calibrer la réponse du détecteur à balayage par trame le talon ci-joint dans le faisceau laser de détection et d'enregistrement des signaux de tension 3D PSD.
- Identifier les axes de cellules longues à l'image de microscope.
- Déplacer des cellules dans les étapes dans une direction perpendiculaire à l'axe de la cellule de long.
- Enregistrement la distance parcourue et le déplacement de la trappe optique.
- Convertir un déplacement à la force appliquée à l'aide de la raideur piège précédemment mesuré et enregistrer le déplacement pointe et la force de déposer.
Les secrets du succès: Dans l'étape 8), on a besoin de trouver une cellule avec une fin bien définis coincé. Certaines cellules sont simplement bloqué à un bout, et la force de flexion à l'extrémité d'autres conduit à un pivotement de cellules entières plutôt que de plier. Une paire convenable soit trouvé en pliant chaque cellule rapidement à la main utilisant la motion à l'étape manette contrôlée.
Les résultats représentatifs:
Figure 1. Cette figure montre force-déplacement des données pour une seule cellule. La pente de cette ligne est la rigidité à la flexion de la cellule.
Discussion
Le protocole présenté ici est conçu pour mesurer quantitativement les propriétés de flexion des cellules bactériennes. La configuration de test peut être appliqué à n'importe quelle cellule en forme de tige qui peut être fait de grandir filamentously. Nous avons utilisé avec succès cette configuration pour sonder les effets des filaments du cytosquelette de la rigidité à la flexion de E. cellules coli. Cette même technique peut être utilisée pour évaluer le rôle de la pression, rigidité de la paroi cellulaire et d'autres composants intracellulaires dans la détermination de l'ensemble rigidité à la flexion des cellules.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous reconnaissons des conseils utiles à partir Mingzhai Soleil sur les cellules se liant à des surfaces. Nous remercions Ned Wingreen et Zemer Gitai des discussions utiles. Cette recherche a été financée par les Instituts nationaux de la santé accorde P50GM07150, la National Science Foundation bourse de carrière PHY-0844466 et la Alfred P. Sloan Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895-5G | |
| polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 181978-5G | |
| polylysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 0.5-μm-diameter polystyrene beads | Bangs Laboratories | PS03N | |
| Nano-LP Series nanopositioning system | Mad City Labs | NanoLP series | http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html |
References
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).
