Summary
Nós apresentamos um protocolo para dobrar filamentosas células bacterianas associadas a uma superfície de tampa de deslizamento com uma armadilha óptica para medir a rigidez de flexão celular.
Abstract
Nós desenvolvemos um protocolo para medir a rigidez de flexão de filamentosas em forma de bastonete. Forças são aplicadas com uma armadilha óptica, uma mola tridimensional microscópicas feitas de luz, que é formado quando uma alta intensidade do feixe de laser é focalizada em um ponto muito pequeno pela objectiva de um microscópio. Para dobrar uma célula, primeiro bind bactérias vivas para uma lamela quimicamente tratados. Como estas células crescem, o meio das células permanece ligada ao lamela, mas as extremidades de crescimento são livres desta restrição. Por induzir crescimento filamentoso com a cefalexina drogas, somos capazes de identificar as células em que uma extremidade da célula estava preso à superfície, enquanto a outra extremidade permaneceu solto e suscetível a forças de flexão. A força de flexão é aplicado com uma armadilha óptica ligando um talão polilisina revestidos para a ponta de uma célula em crescimento. Tanto a força eo deslocamento do cordão de são registrados ea rigidez de flexão da célula é a inclinação dessa relação.
Protocol
- Cultivar células de E. coli em meio de caldo Luria-Beltrani (LB) para a fase exponencial (OD = 0,2-0,4).
- Fazer crescer a cultura em LB suplementado com 50 mg / ml de cefalexina por 15 min para induzir crescimento filamentoso, e depois concentrar a cultura por 5 vezes por centrifugação.
- Faça PEI revestido lamela fluindo polyethylenimine 1% diluído em água em uma câmara de fluxo, e lavar com água depois de uma incubação de 5 minutos.
- O fluxo de cultura de células concentradas na câmara, e lavados com uma mistura de LB e cefalexina (50μg/mL), após 3 min para remover as células solto.
- Incubar na câmara a 37 ° C por 30 min-1 hora para permitir que as células anexado crescer antes de colocar no aparelho captura óptica.
- Faça polilisina revestido contas incubando contas 0,5 mícrons de diâmetro poliestireno (Bangs Labs) em polilisina 0,1% diluído em água por 30 min. Em seguida, lave as contas 3 vezes e ressuspender em água.
- Diluir a solução talão por um fator de dois em LB com cefalexina (50μg/mL), e adicioná-lo na câmara de fluxo.
- Opticamente armadilha um grânulo flutuante e tocá-lo para a ponta livre de uma célula. (Nós usamos uma Cidade Mad Labs estágio piezo para o controle do movimento da amostra.) Quando uma combinação adequada grânulo / célula for encontrada, lavar a câmara com cefalexina no LB (50μg/mL) para remover contas solto.
- Executar custom-written programa LabView para aplicar forças de flexão para celular e força-deslocamento registro de dados. Detalhes do programa
- Calibrar resposta do detector por digitalização raster anexado o talão dentro do feixe de laser de detecção e gravação 3D sinais de tensão PSD.
- Identificar eixo célula longa em imagem do microscópio.
- Mover células em passos em uma direção perpendicular ao eixo de células de comprimento.
- Registrar a distância percorrida eo deslocamento da armadilha óptica.
- Deslocamento para converter a força aplicada usando a rigidez armadilha previamente medidos e salvar o deslocamento da ponta e força para arquivo.
Segredos para o Sucesso: No Passo 8), é preciso encontrar uma célula com um fim bem definidos preso. Algumas células são apenas preso em uma ponta, ea força de dobra na outra ponta leva a um giro de célula inteira, em vez de dobrar. Um par adequado é encontrado dobrando cada célula rapidamente à mão usando o movimento estágio joystick controlado.
Resultados representativos:
Figura 1. Esta figura mostra força-deslocamento de dados para uma única célula. A inclinação desta linha é a rigidez de flexão da célula.
Discussion
O protocolo aqui apresentado foi concebido para medir quantitativamente as propriedades de dobra de células bacterianas. A configuração da experiência pode ser aplicada a qualquer célula em forma de bastonete que podem ser feitas a crescer filamentously. Temos utilizado com sucesso esta configuração para investigar os efeitos de filamentos do citoesqueleto da rigidez de flexão da E. células coli. Essa mesma técnica pode ser usada para avaliar os papéis de pressão rigidez da parede, celulares e outros componentes intracelulares na determinação da rigidez de flexão total de células.
Disclosures
A produção de vídeo deste artigo foi patrocinado pela Mad Cidade Labs, que produz instrumentos utilizados nestes estudos.
Acknowledgments
Reconhecemos conselhos úteis de Mingzhai Sol em células de ligação às superfícies. Agradecemos a Ned Wingreen e Zemer Gitai pelas valiosas discussões. Esta pesquisa foi suportada pelo National Institutes of Health conceder P50GM07150, National Science Foundation concessão de CARREIRA PHY-0844466 e Alfred P. Sloan Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895-5G | |
| polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 181978-5G | |
| polylysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 0.5-μm-diameter polystyrene beads | Bangs Laboratories | PS03N | |
| Nano-LP Series nanopositioning system | Mad City Labs | NanoLP series | http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html |
References
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).
