Summary
Se presenta un protocolo para doblar las células filamentosas bacterianas unidas a una superficie cubierta antideslizante con una trampa óptica para medir la resistencia a la flexión celular.
Abstract
Hemos desarrollado un protocolo para medir la rigidez a la flexión de filamentos en forma de bacilos. Las fuerzas se aplican con una trampa óptica, un microscopio tridimensional primavera hecha de luz que se forma cuando un haz de alta intensidad de láser se enfoca a un lugar muy pequeño por la lente de objetivo de un microscopio. Para doblar una célula, lo primero que se unen las bacterias vivas a un cubreobjetos tratados químicamente. A medida que estas células crecen, la mitad de las células permanece fijo en la cubreobjetos pero los extremos cada vez están libres de esta restricción. Al inducir el crecimiento de filamentosas con la cefalexina de drogas, que son capaces de identificar las células en el que estaba atrapado uno de los extremos de la célula a la superficie, mientras que el otro extremo quedó suelto y susceptible a las fuerzas de flexión. A fuerza de flexión se aplica con una trampa óptica por un cordón de unión polilisina recubiertos en la punta de una célula que crece. Tanto la fuerza y el desplazamiento de la cuenta se registran y la rigidez a la flexión de la célula es la pendiente de esta relación.
Protocol
- Se cultivan las células de E. coli en caldo Luria-beltrani (LB) para la fase exponencial (OD = 0.2-0.4).
- Mantener el cultivo en LB suplementado con 50 mg / ml de cefalexina durante 15 minutos para inducir el crecimiento de filamentosas, y luego se concentran la cultura por 5 veces por centrifugación.
- Hacer PEI cubreobjetos recubiertos por las corrientes de 1% polietilenimina diluida en agua en una cámara de flujo, y lavar con agua después de una incubación de 5 minutos.
- El flujo del cultivo de células concentradas en la cámara, y se lava con una mezcla de LB y cefalexina (50μg/mL) después de 3 minutos para eliminar las células sueltas.
- Incubar la cámara a 37 ° C durante 30 minutos a 1 hora para permitir que las células adjunto crecer antes de colocarlo en el instrumento de captura óptica.
- Hacer polilisina revestida de piedras mediante la incubación de 0,5 m de diámetro, bolas de poliestireno (Laboratorios explosiones) en el 0,1% de polilisina diluido en agua durante 30 minutos. Luego lave las cuentas 3 veces y se resuspenden en agua.
- Diluir la solución de cuentas por un factor de dos en LB con cefalexina (50μg/mL), y agregarlo a la cámara de flujo.
- Ópticamente una trampa flotante de cuentas y el tacto a la extremidad libre de una célula. (Nosotros usamos un Mad City Laboratorios etapa piezoeléctricos para el control del movimiento de la muestra.) Cuando una combinación adecuada de cuentas / célula se encuentra, lavar la cámara con cefalexina en LB (50μg/mL) para eliminar las perlas sueltas.
- Ejecutar custom-written programa LabView para aplicar las fuerzas de flexión a la celda y registrar los datos de fuerza-desplazamiento. Detalles del programa
- Calibrar la respuesta del detector de barrido de exploración que se adjunta en el cordón de rayo láser de detección y registro de las señales de tensión en 3D PSD.
- Identificar el eje de células largas a la imagen de microscopio.
- Mover celdas en los pasos en una dirección perpendicular al eje de la célula de largo.
- Registrar la distancia recorrida y el desplazamiento de la trampa óptica.
- Convertir el desplazamiento a la fuerza aplicada con la rigidez trampa medido previamente y guardar desplazamiento de su punta y la fuerza de archivo.
Secretos para el éxito: En el paso 8), se necesita encontrar una celda con un fin bien definido atascado. Algunas células son atrapados en un extremo, y la fuerza de flexión en la otra punta lleva a un giro de células enteras en lugar de doblar. Un par adecuado se encuentra al doblar cada célula rápidamente a mano con el movimiento etapa joystick controlado.
Los resultados representativos:
Figura 1. Esta figura muestra de fuerza-desplazamiento de datos para una sola celda. La pendiente de esta línea es la rigidez a la flexión de la célula.
Discussion
El protocolo que aquí se presenta está diseñado para medir cuantitativamente las propiedades de flexión de las células bacterianas. El montaje del experimento se puede aplicar a cualquier celda en forma de bastón que se puede hacer para crecer filamentously. Hemos utilizado con éxito este programa de instalación para investigar los efectos de los filamentos del citoesqueleto en la resistencia a la flexión de la E. células de E. coli. Esta misma técnica se puede utilizar para evaluar el papel de la presión, la rigidez de la pared celular y otros componentes intracelulares en la determinación de la rigidez general de la flexión de las células.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Reconocemos útiles consejos de Mingzhai Sol en las células de la unión a las superficies. Agradecemos a Ned Wingreen y Gitai Zemer valiosa para los debates. Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud de subvención P50GM07150, premio Nacional de Ciencias CARRERA Fundación PHY-0844466 y la Fundación Alfred P. Sloan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895-5G | |
| polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 181978-5G | |
| polylysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 0.5-μm-diameter polystyrene beads | Bangs Laboratories | PS03N | |
| Nano-LP Series nanopositioning system | Mad City Labs | NanoLP series | http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html |
References
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).
