Summary
Vi presenterar ett protokoll för bockning fintrådiga bakterieceller knuten till en cover-slip yta med en optisk fälla för att mäta cellulär böjstyvhet.
Abstract
Vi utvecklade ett protokoll för att mäta böjning styvhet av fintrådiga stavformade bakterier. Anbringas med en optisk fälla, en mikroskopisk tredimensionell fjäder av ljus som bildas när en högintensiv laserstråle fokuseras till en mycket liten fläck av ett mikroskop är objektiv. Att böja en cell binder vi först levande bakterier till ett kemiskt behandlade täckglas. Eftersom dessa celler växer, är mitt i cellerna bundna till täckglas, men de växande ändar är fria från denna återhållsamhet. Genom att inducera fintrådiga tillväxt med läkemedlet cefalexin, kan vi identifiera celler där ena änden av cellen satt fast på ytan medan den andra änden var lös och är mottagliga för bockning styrkor. En böjning kraft tillämpas sedan med en optisk fälla genom att binda en polylysine-belagd pärla till toppen av en växande cell. Både kraft och den förskjutning av pärla registreras och böjstyvhet i cellen är lutningen av denna relation.
Protocol
- Väx E. coli celler i Luria-Beltrani buljong (LB) medelstora till exponentiell fas (OD = 0,2 till 0,4).
- Odla kulturen i LB kompletterats med 50 mikrogram / ml cefalexin i 15 min att förmå fintrådiga tillväxt, och sedan koncentrera kulturen med 5 gånger genom centrifugering.
- Gör PEI-belagd täckglas med flödande 1% polyethylenimine utspädd i vatten i ett flöde kammare, och tvätta med vatten efter en 5-minuters inkubation.
- Flow den koncentrerade cellodling in i kammaren, och tvättas med en blandning av LB och cefalexin (50μg/mL) efter 3 min för att avlägsna lös celler.
- Inkubera kammaren vid 37 ° C i 30 min-1 timme för att låta den bifogade cellerna växa innan placering på den optiska fällor instrumentet.
- Gör polylysine-belagda kulor genom inkubering 0,5-ìm diameter polystyren pärlor (Bangs Labs) på 0,1% polylysine utspätt i vatten i 30 min. Tvätta sedan kulorna 3 gånger och återsuspendera i vatten.
- Späd pärla lösningen med en faktor två i LB med cefalexin (50μg/mL), och lägg den i flödet kammaren.
- Optiskt fälla en flytande pärla och röra vid den för den fria änden av en cell. (Vi använder en Mad stad Labs piezo scenen till rörelsekontroll av provet.) När en lämplig sträng / cell kombination hittas, tvätta kammaren med cefalexin i LB (50μg/mL) för att avlägsna lös pärlor.
- Kör anpassade skrivna LabView program för att ansöka Bockkrafterna till cell och registrera kraft-förskjutning data. Program detaljer
- Kalibrera detektorn svar från raster scanning bifogade pärla inom upptäckt laserstrålen och inspelning 3D PSD signaler spänning.
- Identifiera cell långa axeln i mikroskop bild.
- Flytta cell i steg i en riktning vinkelrätt mot cellen längdaxel.
- Spela in avståndet flyttas och förskjutningen från den optiska fällan.
- Konvertera förskjutning till tillämpad kraft genom att använda tidigare uppmätta fällan stelhet och spara spets förskjutning och kraft till fil.
Hemligheter till framgång: I steg 8), måste man hitta en cell med en fast väldefinierat slut. Vissa celler är bara fast på en spets, och böjning kraft på den andra spetsen leder till en hel-cell svängbar stället böjning. En lämplig par hittas genom att böja varje cell snabbt för hand med joysticken kontrollerade scenen rörelse.
Representativa resultat:
Figur 1. Denna siffra visar kraft-förskjutning data för en enda cell. Lutningen för denna linje är böjstyvhet i cellen.
Discussion
Protokollet som presenteras här är utformade för att kvantitativt mäta böjning egenskaper bakterieceller. Det experimentet kan tillämpas på alla stav-formade celler som kan göras för att växa filamentously. Vi har framgångsrikt använt denna inställning för att undersöka effekterna av cytoskelettala filament på böjstyvhet i E. coli celler. Samma teknik kan användas för att utvärdera roller tryck, cellvägg stelhet och andra intracellulära komponenter för att bestämma totala böjstyvhet av celler.
Disclosures
Videon produktionen av denna artikel var sponsrad av Mad Stad Labs, som tillverkar instrument som används i dessa studier.
Acknowledgments
Vi erkänner goda råd från Mingzhai Sun på bindande celler till ytor. Vi tackar Ned Wingreen och Zemer Gitai för värdefulla diskussioner. Denna forskning stöds av National Institutes of Health bidrag P50GM07150, National Science Foundation KARRIÄR utmärkelse PHY-0.844.466 och Alfred P. Sloan Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895-5G | |
| polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 181978-5G | |
| polylysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 0.5-μm-diameter polystyrene beads | Bangs Laboratories | PS03N | |
| Nano-LP Series nanopositioning system | Mad City Labs | NanoLP series | http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html |
References
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).
