Overview
嗜血性血淋巴作为血液和间体液，在幼虫和成人阶段在整个身体循环。此视频描述了收集幼虫血淋巴以量化循环细胞的协议。
Protocol
本协议摘自雷梅尔斯和普弗莱格，方法检查淋巴腺和血细胞在德罗索菲拉拉瓦，J.Vis.Exp.（2016年）。
1. 循环体细胞浓度
- 为了获得这种测定大致相同的发育阶段的幼虫，通过允许雌性在2-6小时的固定时间段内产卵来限制卵子的收集。
- 收集幼虫在解剖盘井充满了1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
- 对于每个幼虫，将 10 μl 1x PBS 放在冰上的微中轴管中，将 10μl 1x PBS 放在干净的解剖垫上。将解剖垫放在照明立体显微镜底座上。
- 干燥单个幼虫，将其放在组织抹布上，然后将其转移到解剖垫上的 PBS 滴。
- 使用一对钳子，轻轻撕开并小心地倒置基质层以释放淋巴。
注： 小心不要刮或刺的皮质层，因为这可能会释放囊泡异细胞。 - 使用管道，从解剖垫中收集淋巴。避免收集幼虫碎片，如脂肪体。
- 将血淋巴加入微中管中，通过上下管道混合。
注： 几个样品可以一次收集，并在冰上保存长达一个小时。 - 可选：将Trypan蓝色与血淋巴样本混合，以相等的份量染色并排除死细胞。在添加 Trypan 蓝色后 3 分钟内计算细胞， 因为它对细胞有毒。
- 在将 10 μl 加载到血细胞仪室之前，通过上下管道混合样品。
- 如果使用自动单元格计数器，则为单元格大小和循环设置适当的参数。例如，设置 2μm 的最小细胞大小、22μm 的最大细胞大小和 75 - 80% 圆度的圆形，以检测正常圆形血细胞。使用不同的参数进行实验，以检测更大和主轴形状的同体细胞，如跛脚细胞。或者，使用测高仪手动计算赫莫西特。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 |
