Störung der Nagelhaut: Eine Methode zum Sammeln von Hämolymphe aus Drosophila-Larven

Abstract

Quelle: Reimels, T. A. und Pfleger, C. M. Methoden zur Untersuchung der Lymphdrüse und der Hämozyten in Drosophila-Larven. J. Vis. Exp. (2016).

Die Drosophila-Hämolymphe dient sowohl als Blut als auch als interstitielle Flüssigkeit und zirkuliert während des Larven- und Erwachsenenstadiums durch den Körper. Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Entnahme von Hämolymphlarven, um die zirkulierenden Zellen zu quantifizieren.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Reimels und Pfleger, Methoden zur Untersuchung der Lymphdrüse und der Hämozyten in Drosophila-Larven, J. Vis.(2016).

1. Zirkulierende Hämozytenkonzentration

1. Um Larven mit ungefähr dem gleichen Entwicklungsstadium für diesen Test zu erhalten, beschränken Sie die Eizellentnahme, indem Sie den Weibchen erlauben, Eier für einen festgelegten Zeitraum von 2 - 6 Stunden zu legen.
2. Sammeln Sie die Larven in Präparierschalen, die mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt sind.
3. Für jede Larve werden 10 μl 1x PBS in ein Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und 10 μl 1x PBS auf ein sauberes Präparierpad gegeben. Legen Sie das Präparierpad auf eine beleuchtete Stereomikroskopbasis.
4. Trocknen Sie eine einzelne Larve, indem Sie sie auf ein Gewebetuch legen, bevor Sie sie in einen PBS-Tropfen auf dem Sezierpad übertragen.
5. Reißen Sie die Nagelhaut mit einer Pinzette vorsichtig auf und drehen Sie sie vorsichtig um, um die Hämolymphe freizusetzen.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, die Nagelhaut nicht zu kratzen oder zu stechen, da dies möglicherweise sitzende Blutzellen freisetzen könnte.
6. Entnehmen Sie mit einer Pipette die Hämolymphe vom Präparierkissen. Vermeiden Sie das Sammeln von Larvenresten wie dem Fettkörper.
7. Geben Sie die Hämolymphe in ein Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie, indem Sie auf und ab pipettieren.
   HINWEIS: Es können mehrere Proben auf einmal entnommen und bis zu einer Stunde auf Eis gehalten werden.
8. Optional: Mischen Sie Trypanblau zu gleichen Teilen mit der Hämolymphprobe, um abgestorbene Zellen zu färben und auszuschließen. Zählen Sie die Zellen innerhalb von 3 Minuten nach der Zugabe von Trypanblau, da es für die Zellen giftig ist.
9. Mischen Sie die Probe, indem Sie auf und ab pipettieren, bevor Sie 10 μl in eine Hämozytometerkammer laden.
10. Wenn Sie einen automatisierten Zellzähler verwenden, stellen Sie geeignete Parameter für Zellgröße und Zirkularität ein. Legen Sie beispielsweise eine minimale Zellgröße von 2 μm, eine maximale Zellgröße von 22 μm und eine Rundheit von 75 - 80 % fest, um normale, runde Hämozyten zu erkennen. Experimentieren Sie mit verschiedenen Parametern, um größere und spindelförmige Hämozyten, wie z. B. Lamellozyten, zu erkennen. Alternativ können Sie ein Hämozytometer verwenden, um Hämozyten manuell zu zählen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS-Tabletten	MP Biomedizin	2810305
Präparierschale	Corning	7220-85
Mikrozentrifugen-Röhrchen	Denville	Nr. C2170
Silikon-Präparierpad, hergestellt aus Sylgard 184 Kit	Krayden (vertrieben über Fisher)	NC9644388 (Fisher-Katalognummer)	Hergestellt in der Petrischale durch Mischen der Komponenten des Sylgard-Elastomer-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
stereomikroskop	Morrell Instruments (Nikon-Händler)	MNA42000, MMA36300	Nikon-Modelle SMZ1000 und SMZ645
Tuch für Taschentücher	VWR	Nr. 82003-820
Zange	Elektronenmikroskopie	72700-DZ
P200 Pipette	Eppendorf	3120000054
Gräfin Automatisierter Zellzähler	Invitrogen	Nr. C10227
Countess Zellzählkammer Objektträger	Invitrogen	Nr. C10283
Hämozytometer	Hausser Scientific	3200
Trypanblaue Beize	Lebenstechnologien	Nr. T10282