Overview
Die Drosophila Hämolymphe dient sowohl als Blut und interstitielle Flüssigkeit, zirkuliert im ganzen Körper während der Larve und Erwachsenenstadien. Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Sammlung von Larvenhämolympiden, um die zirkulierenden Zellen zu quantifizieren.
Protocol
Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Reimels und Pfleger, Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2016).
1. Zirkulierende Hämozytenkonzentration
- Um Larven von ungefähr der gleichen Entwicklungsstufe für diesen Test zu erhalten, beschränken Sie die Eiersammlung, indem sie Den Weibchen erlauben, Eier für einen bestimmten Zeitraum von 2 - 6 Stunden zu legen.
- Larven in Sezieren von Tellerbrunnen sammeln, die mit 1x Phosphat gepufferter Saline (PBS) gefüllt sind.
- Legen Sie für jede Larve 10 l 1x PBS in einem Mikrozentrifugenrohr auf Eis und 10 l 1x PBS auf ein sauberes Sezieren. Legen Sie das Sezieren von Pads auf eine beleuchtete Stereomikroskopbasis.
- Trocknen Sie eine einzelne Larve, indem Sie sie auf ein Gewebetuch legen, bevor Sie sie auf einen PBS-Tropfen auf dem Sezierpad übertragen.
- Mit einem Paar Zange, sanft aufreißen und vorsichtig invertieren die Nagelhaut, um die Hämolymphe freizugeben.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Nagelhaut nicht zu kratzen oder zu jaben, da dies möglicherweise sessile Hämozyten freisetzen könnte. - Mit einer Pipette, sammeln Sie die Hämolymphe aus dem Sezieren Pad. Vermeiden Sie das Sammeln von Larvenablagerungen wie dem Fettkörper.
- Fügen Sie die Hämolymphe in ein Mikrozentrifugenrohr und mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten.
HINWEIS: Mehrere Proben können auf einmal gesammelt und bis zu einer Stunde auf Eis gehalten werden. - Optional: Mischen Sie Trypan blau mit der Hämolymphprobe zu gleichen Teilen, um abgestorbene Zellen zu färben und auszuschließen. Zählen Sie Zellen innerhalb von 3 min der Zugabe von Trypan blau, weil es toxisch für Zellen ist.
- Mischen Sie die Probe, indem Sie nach oben und unten pfeifen, bevor Sie 10 l in eine Hämozytometerkammer laden.
- Wenn Sie einen automatisierten Zellenzähler verwenden, legen Sie geeignete Parameter für Zellengröße und Zirkularität fest. Legen Sie z. B. eine minimale Zellgröße von 2 m, eine maximale Zellgröße von 22 m und eine Rundhekalität von 75 - 80 % Rundheit fest, um normale, runde Häozyten zu erkennen. Experimentieren Sie mit verschiedenen Parametern, um größere und spindelförmige Hämozyten, wie Lamellozyten, zu erkennen. Alternativ können Sie ein Hämozytometer verwenden, um Hämozyten manuell zu zählen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 |
