Overview
המולימפה Drosophila משמש הן דם נוזל ביניים, במחזור בכל הגוף במהלך הזחל ואת השלבים הבוגרים. וידאו זה מתאר פרוטוקול כדי לאסוף hemolymph הזחל על מנת לכמת את התאים במחזור.
Protocol
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך ריימלס ו Pfleger, שיטות לבחון את בלוטת הלימפה ואת המוציטים בזחלים Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. ריכוז המוצית במחזור
- כדי להשיג זחלים של בערך באותו שלב התפתחותי עבור סקירה זו, להגביל את איסוף הביצים על ידי מתן אפשרות לנקבות להטיל ביצים לתקופה קבועה של 2 - 6 שעות.
- לאסוף זחלים בארות צלחת ניתוח מלא 1x פוספט אגירה מלוחים (PBS).
- עבור כל זחל, מניחים 10 μl 1x PBS בצינור microcentrifuge על קרח ו 10 μl 1x PBS על כרית ניתוח נקי. הנח את משטח הניתוק על בסיס סטריאומיקרוסקופ מואר.
- יבש זחל בודד על ידי הנחתו על מגבון רקמה לפני העברתו לנפילת PBS על כרית הניתוח.
- באמצעות זוג מלקחיים, קרע בעדינות פתוח בזהירות להפוך את הקוטיקל כדי לשחרר את hemolymph.
שים לב: היזהר לא לגרד או לדקור את הקוטיקל כמו זה עלול לשחרר hemocytes sessile. - באמצעות צינור, לאסוף את hemolymph מן כרית הניתוח. הימנע איסוף פסולת זחל כגון גוף השומן.
- מוסיפים את ההמולימפה לצינור מיקרוצנטריפוג ומערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה.
שים לב: ניתן לאסוף מספר דגימות בבת אחת ושמורות על קרח עד שעה. - אופציונלי: מערבבים את כחול Trypan עם דגימת hemolymph בחלקים שווים כדי לצבוע ולא לכלול תאים מתים. לספור תאים בתוך 3 דקות של הוספת כחול Trypan כי זה רעיל לתאים.
- מערבבים את הדגימה על ידי pipetting למעלה ולמטה לפני טעינת 10 μl לתוך תא hemocytometer.
- אם אתה משתמש במונה תאים אוטומטי, הגדר פרמטרים מתאימים עבור גודל תא ומעגליות. לדוגמה, הגדר גודל תא מינימלי של 2 מיקרומטר, גודל תא מרבי של 22 מיקרומטר, ומעוגליות של 75 - 80% מעוגלה כדי לזהות המוציטים רגילים ועגולים. התנסה בפרמטרים שונים כדי לזהות המוציטים גדולים יותר בצורת ציר, כגון למלוציטים. לחלופין, השתמש בהמוציטרומטר כדי לספור באופן ידני המוציטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 |
