Overview
ショウジョウバエの溶血は、幼虫および成人期に全身を循環する血液および間質液の両方として機能する。このビデオでは、循環細胞を定量化するために幼虫のヘモリンフを収集するプロトコルについて説明します。
Protocol
このプロトコルは、ライメルスとPflegerからの抜粋です,ショウジョウバエラルヴェのリンパ腺と血球を調べる方法, J. Vis. Exp. (2016).
1. 循環性ヘモサイト濃度
- このアッセイの発達段階とほぼ同じ幼虫を得るために、メスが2〜6時間の一定期間卵を産むことを許可することによって卵の採取を制限する。
- 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たされた皿の井戸を解剖で幼虫を収集します。
- 各幼虫に対して、氷の上のマイクロ遠心分離チューブに10 μl 1x PBSを、きれいな解剖パッドに10 μl 1x PBSを置きます。解剖パッドを照らされた立体顕微鏡ベースに置きます。
- 組織拭き取りに置いてから、解剖パッドのPBSドロップに移して、個々の幼虫を乾燥させます。
- 鉗子のペアを使用して、穏やかに開いて引き裂き、慎重にヘモリンフを解放するためにキューティクルを反転させます。
注: これは潜在的に胞性血球を放出する可能性がありますので、キューティクルを削ったりジャブしたりしないように注意してください。 - パイプを使用して、解剖パッドからヘモリンパを収集します。脂肪体などの幼虫の破片を収集しないでください。
- マイクロ遠心分離チューブにヘモリンフを加え、上下にピペットで混ぜます。
注: 一度に複数のサンプルを採取し、氷の上に1時間まで保管することができます。 - 任意:トリパンブルーとヘモリンプサンプルを等しい部分に混ぜて、死んだ細胞を染め、除外します。それは細胞に有毒であるため、トリパンブルーを追加してから3分以内に細胞を数えます。
- 10 μlをヘモサイトメーターチャンバーにセットする前に、上下にピペットしてサンプルを混ぜます。
- 自動セル カウンターを使用する場合は、セルサイズと円形に適切なパラメーターを設定します。例えば、最小セルサイズを2μm、最大セルサイズを22μm、円形を75~80%の丸みを設定して、通常の丸い血球を検出します。ラメロス細胞など、より大きくスピンドル状の血球を検出するために、さまざまなパラメータを試します。あるいは、血球を手動で数えるために血球計を使用する。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 |
