Summary
हम झुकने filamentous जीवाणु के लिए सेलुलर झुकने कठोरता को मापने के लिए एक ऑप्टिकल जाल के साथ एक कवर पर्ची सतह से जुड़ी कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
हम एक filamentous छड़ के आकार के बैक्टीरिया के झुकने कठोरता को मापने के लिए प्रोटोकॉल विकसित किया है. बल एक ऑप्टिकल जाल, प्रकाश की एक सूक्ष्म तीन आयामी बनाया है कि वसंत का गठन किया है जब एक उच्च तीव्रता लेजर बीम एक खुर्दबीन के उद्देश्य लेंस के द्वारा एक बहुत छोटी जगह पर ध्यान केंद्रित है के साथ लागू कर रहे हैं. एक सेल मोड़, हम पहली बार एक रासायनिक इलाज coverslip बाँध जीवित बैक्टीरिया. के रूप में इन कोशिकाओं के विकास, कोशिकाओं के बीच coverslip करने के लिए बाध्य रहता है, लेकिन बढ़ रही समाप्त होता है इस संयम से मुक्त कर रहे हैं. दवा cephalexin साथ filamentous विकास उत्प्रेरण करके, हम करने के लिए कोशिकाओं में जो सेल के एक छोर की सतह के लिए अटक गया था जबकि दूसरे छोर स्वाधीन बने रहे और झुकने बलों को अतिसंवेदनशील की पहचान करने में सक्षम हैं. एक झुकने बल तो एक polylysine लेपित मनका एक से बढ़ सेल की टिप करने के लिए बाध्य है एक ऑप्टिकल जाल के साथ लागू होता है. दोनों बल और मनका के विस्थापन दर्ज कर रहे हैं और सेल के झुकने कठोरता इस रिश्ते की ढलान है.
Protocol
- Luria Beltrani शोरबा मध्यम (पौंड) में ई. कोलाई कोशिकाओं घातीय चरण (= आयुध डिपो .2-0.4) के लिए आगे बढ़ें.
- 15 filamentous वृद्धि प्रेरित मिनट के लिए 50 μg / एमएल cephalexin के साथ पूरक लेग में संस्कृति आगे बढ़ें, और तब संस्कृति centrifugation के माध्यम से 5 गुना से ध्यान केंद्रित.
- 1% एक प्रवाह कक्ष में पानी में पतला polyethylenimine बह द्वारा पी - लेपित coverslip बनाओ, और एक 5 मिनट ऊष्मायन के बाद पानी से धो.
- चैम्बर में केंद्रित सेल संस्कृति फ्लो, पौंड और cephalexin (50μg/mL) का एक मिश्रण के साथ धोया 3 मिनट के बाद स्वाधीन कोशिकाओं को हटाने के लिए.
- 37 पर चैम्बर सेते डिग्री सेल्सियस के लिए 30 मिनट 1 घंटे के लिए संलग्न कोशिकाओं ऑप्टिकल फँसाने साधन पर नियुक्ति से पहले हो जाना.
- 30 मिनट के लिए पानी में पतला 0.1% polylysine में 0.5-सुक्ष्ममापी व्यास polystyrene मनकों (बैंग्स लैब्स) incubating द्वारा polylysine लिपटे मोतियों बनाओ. फिर मोती 3 बार धोने और पानी में resuspend.
- दो का एक पहलू द्वारा cephalexin (50μg/mL) के साथ लेग में मनका समाधान, पतला और यह प्रवाह चैम्बर में जोड़ें.
- ऑप्टिकली एक अस्थायी मनका जाल और यह एक सेल से मुक्त टिप करने के लिए स्पर्श. (हम एक पागल सिटी लैब्स piezo मंच का उपयोग करने के लिए नमूने की गति के नियंत्रण), जब एक उपयुक्त / मनका सेल संयोजन पाया जाता है, cephalexin के साथ लेग (50μg/mL) में कक्ष स्वाधीन मोती हटाने धोने.
- सेल और रिकॉर्ड बल विस्थापन डेटा झुकने बलों लागू कस्टम लिखा LabVIEW प्रोग्राम चलाएँ. प्रोग्राम का विवरण
- रेखापुंज पता लगाने के लेजर बीम और रिकॉर्डिंग 3D PSD वोल्टेज संकेतों के भीतर संलग्न मनका स्कैनिंग द्वारा डिटेक्टर प्रतिक्रिया जांचना.
- सेल माइक्रोस्कोप छवि में लंबे अक्ष को पहचानें.
- सेल सेल लंबे अक्ष को सीधा दिशा में कदम में ले जाएँ.
- चले गए ऑप्टिकल जाल से विस्थापन और दूरी रिकॉर्ड.
- लागू पहले मापा जाल कठोरता का उपयोग बल विस्थापन में कनवर्ट करना और टिप विस्थापन और बल फ़ाइल को बचाने.
सफलता के लिए रहस्य: चरण 8 में), एक के लिए एक अच्छी तरह से परिभाषित अटक अंत के साथ एक सेल मिल की जरूरत है. कुछ कोशिकाओं को बस एक टिप, और अन्य नोक पर झुकने बल पर अटक कर रहे हैं एक पूरे सेल के बजाय pivoting झुकने की ओर जाता है है. एक उपयुक्त जोड़ी प्रत्येक कोशिका चरण जोस्टिक नियंत्रित गति का उपयोग कर हाथ से जल्दी झुकने से पाया जाता है.
प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1. यह आंकड़ा किसी एकल कक्ष के लिए बल विस्थापन डेटा से पता चलता है. इस लाइन की ढलान सेल के झुकने कठोरता है.
Discussion
प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत करने के लिए मात्रात्मक बैक्टीरियल कोशिकाओं के झुकने गुणों को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है. प्रयोग सेटअप कि filamentously बढ़ने के लिए बनाया जा सकता है किसी भी छड़ के आकार का कक्ष के लिए लागू किया जा सकता है. हम सफलतापूर्वक इस सेटअप का इस्तेमाल किया है ई. के झुकने कठोरता पर cytoskeletal filaments के प्रभाव की जांच कोलाई कोशिकाओं. यह वही तकनीक दबाव, कोशिका दीवार और कक्षों की कुल झुकने कठोरता निर्धारित करने में कठोरता अन्य intracellular घटकों की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Disclosures
इस लेख के वीडियो उत्पादन पागल सिटी लैब्स, जो इन अध्ययनों में प्रयुक्त उपकरणों का उत्पादन द्वारा प्रायोजित किया गया था.
Acknowledgments
हम Mingzhai सूर्य से सतहों के लिए बाध्य कोशिकाओं पर उपयोगी सलाह को स्वीकार करते हैं. हम बहुमूल्य विचार - विमर्श के लिए नेड Wingreen और Zemer Gitai धन्यवाद. इस शोध स्वास्थ्य अनुदान P50GM07150 के राष्ट्रीय संस्थानों, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन कैरियर पुरस्कार बनावट - 0,844,466 और अल्फ्रेड पी. स्लोअन फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895-5G | |
| polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 181978-5G | |
| polylysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 0.5-μm-diameter polystyrene beads | Bangs Laboratories | PS03N | |
| Nano-LP Series nanopositioning system | Mad City Labs | NanoLP series | http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html |
References
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).
