Summary
Vi presentiamo un protocollo per la piegatura di cellule batteriche filamentose attaccato ad una copertura antiscivolo della superficie di un dispositivo ottico per misurare la rigidità cellulare flessione.
Abstract
Abbiamo sviluppato un protocollo per misurare la rigidità flessione di filamentose a forma di bastoncello batteri. Le forze sono applicate con una trappola ottica, un microscopico tridimensionale primavera fatta di luce che si forma quando ad alta intensità del fascio laser viene focalizzato in un punto molto piccolo da lente dell'obiettivo di un microscopio. Per piegare una cella, per prima cosa si legano batteri vivi ad un trattato chimicamente coprioggetto. Poiché queste cellule crescono, la metà delle cellule rimane vincolato alla coprioggetto, ma le estremità in crescita sono liberi di questa restrizione. Inducendo crescita filamentosa con la cefalexina droga, siamo in grado di identificare le cellule in cui è stato bloccato un'estremità della cellula per la superficie, mentre l'altra estremità è rimasto libero e suscettibile alle forze di flessione. A forza di piega viene poi applicata con una trappola ottica di associazione di un polilisina rivestita tallone alla punta di una cellula in crescita. Sia la forza e lo spostamento del tallone sono registrati e la rigidezza flessionale della cellula è la pendenza di questa relazione.
Protocol
- Crescere le cellule di E. coli in brodo Luria-Beltrani (LB), medio-fase esponenziale (OD = 0,2-0,4).
- Far crescere la coltura in LB integrata con 50 mg / ml di cefalexina per 15 minuti per indurre la crescita filamentosa, e poi concentrare la cultura di 5 volte tramite centrifugazione.
- Fai PEI rivestite da copri scorre 1% polyethylenimine diluito in acqua in una camera di flusso, e lavare con acqua dopo 5 minuti di incubazione.
- Flusso della cultura concentrato di cellule nella camera, e lavato con una miscela di LB e cefalexina (50μg/mL) dopo 3 min per rimuovere le cellule senza legami.
- Incubare la camera a 37 ° C per 30 min-1 ora per far crescere le cellule attaccato prima di posizionarlo nello strumento ottico cattura.
- Fai polilisina rivestite perle incubando 0,5 micron di diametro perle di polistirene (Labs Bangs) nel 0,1% polilisina diluito in acqua per 30 min. Quindi lavare le perline 3 volte e risospendere in acqua.
- Diluire il tallone di un fattore due in LB con cefalexina (50μg/mL), e aggiungerlo nella camera di flusso.
- Otticamente intercettare un galleggiante tallone e toccare alla punta libera di una cella. (Usiamo un Mad City Labs fase piezoelettrici per il controllo del moto del campione.) Quando una combinazione adatta perla / cellula viene trovato, lavare la camera con cefalexina in LB (50μg/mL) per rimuovere perline separati.
- Eseguire programma appositamente scritto LabView di applicare forze di piegatura alla cella e registrare forza-spostamento dei dati. Dettagli del programma
- Calibrare la risposta del rivelatore da raster scansione del tallone allegato all'interno del raggio laser di rilevamento e la registrazione di segnali in tensione 3D PSD.
- Identificare asse lungo cellula immagine al microscopio.
- Spostare celle a passi in una direzione perpendicolare all'asse lunga cella.
- Registrare la distanza percorsa e lo spostamento dalla trappola ottica.
- Conversione spostamento di forza applicata con la rigidità trappola precedentemente misurati e salvare spostamento punta e forza in un file.
Segreti di successo: Nel passaggio 8), si ha la necessità di trovare una cella con un ben definito fine bloccato. Alcune cellule sono semplicemente bloccati in una sola punta, e la forza di piega alla punta che conduce a un insieme di cellule girevole, piuttosto che piegarsi. Una coppia adatta si trova piegando ogni cella rapidamente a mano utilizzando il joystick controllato movimento palco.
Rappresentante dei risultati:
Figura 1. La figura mostra forza-spostamento di dati per una singola cella. La pendenza di questa linea è la rigidezza flessionale della cellula.
Discussion
Il protocollo presentato qui è progettato per misurare quantitativamente la piegatura delle cellule batteriche. Il setup esperimento può essere applicato a qualsiasi forma di bastoncello cella che può essere fatto per crescere filamentously. Abbiamo usato con successo questa configurazione per sondare gli effetti dei filamenti del citoscheletro sulla rigidità alla flessione di E. coli cellule. Questa stessa tecnica può essere usata per valutare i ruoli di pressione, rigidità della parete cellulare e gli altri componenti intracellulari nella determinazione complessiva rigidità alla flessione delle cellule.
Disclosures
La produzione video di questo articolo è stato sponsorizzato da Mad Città Labs, che produce strumenti utilizzati in questi studi.
Acknowledgments
Riconosciamo consigli utili da Mingzhai Sole su cellule vincolanti alle superfici. Ringraziamo Ned Wingreen e zemer Gitai per le discussioni importanti. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health concedere P50GM07150, National Science Foundation riconoscimento alla CARRIERA PHY-0844466 e la Fondazione Alfred P. Sloan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895-5G | |
| polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 181978-5G | |
| polylysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 0.5-μm-diameter polystyrene beads | Bangs Laboratories | PS03N | |
| Nano-LP Series nanopositioning system | Mad City Labs | NanoLP series | http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html |
References
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).
