Summary
Мы представляем протокол для гибки нитевидные клетки бактерий придает покрытие скольжения поверхности с оптической ловушки для измерения сотовой жесткость на изгиб.
Abstract
Мы разработали протокол для измерения жесткость при изгибе нитчатых палочковидные бактерии. Силы применяются с оптической ловушки, микроскопические трехмерные весной из легких, которая образуется при высокой интенсивности лазерного луча ориентирован на очень маленькое пятно на объектив микроскопа. Чтобы согнуть клетки, мы прежде не свяжет живых бактерий в химически обработанных покровное. Поскольку эти клетки растут, в середине клетки остается связанным с покровным но растущие концы свободны от этого ограничения. По вызывающих рост нитчатых с наркотиками цефалексин, мы можем идентифицировать клетки, в которых один конец ячейки прилипла к поверхности, а другой конец остались одинокие и чувствительны к изгибу сил. Изгибающего усилия затем применяется с оптической ловушки, связывая полилизином покрытием шарик на кончике растущих клеток. Обе силы и перемещения шарика записываются и жесткость на изгиб ячейка склоне этой связи.
Protocol
- Расти клетки E.coli в Лурия-Beltrani бульона (LB) среды к экспоненциальной фазы (OD = 0,2-0,4).
- Рост культуры в LB дополнена с 50 мкг / мл цефалексин в течение 15 мин, чтобы вызвать рост нитчатых, а затем сосредоточиться культуры в 5 раз путем центрифугирования.
- Сделать PEI покрытием покровное путем пропускания 1% полиэтиленимина, разбавленным водой в проточную камеру, а также мыть с водой после 5-минутной инкубации.
- Поток концентрированного культуре клеток в камере, и промывают смесью LB и цефалексин (50μg/mL) через 3 мин, чтобы удалить одиноких клеток.
- Инкубируйте камере при температуре 37 ° С в течение 30 мин-1 час, чтобы прилагается клетки растут перед размещением на оптический инструмент захвата.
- Сделать полилизином покрытием бусин путем инкубации 0,5-мкм диаметром полистирола (Bangs Labs) в 0,1% полилизином разводят в воде в течение 30 мин. Затем промыть бисером 3 раза и ресуспендируют в воде.
- Развести бусинка решение по два раза в LB с цефалексин (50μg/mL), и добавить его в проточную камеру.
- Оптически ловушку плавающего шарика и прикоснуться к ней, чтобы свободный кончик клетки. (Мы используем Безумный город Labs пьезо этапе управления движением образца.) Когда подходящий шарик / элемент комбинации найден, мыть камеру с цефалексин в LB (50μg/mL), чтобы удалить одиноких бисером.
- Выполнить заказ письменного LabView программу применить изгибающие силы к клетке и записи сила-смещение данных. Детали программы
- Калибровка детектора путем сканирования растровых прилагается шарик внутри пучка лазерного обнаружения и записи 3D PSD сигналы напряжения.
- Определить клетка длинная ось в микроскопе изображение.
- Переместить ячейки шаги в направлении, перпендикулярном к ячейке длинной оси.
- Запись расстоянии двигался и смещения от оптической ловушке.
- Преобразование смещение приложенной силы с использованием ранее измеряется ловушку жесткость и сохранить смещение наконечника и силой в файл.
Секреты успеха: В шаге 8), нужно найти ячейки с четко определенными застряли конца. Некоторые клетки просто застрял на один наконечник, и изгибающего усилия на другом кончике приводит к цельноклеточная поворотным, а не гибки. Подходящей пары находят изгиба каждой клетки быстро вручную с помощью джойстика контролируемой стадии движения.
Представитель Результаты:
Рисунок 1. На этом рисунке показана сила-смещение данных по одной ячейке. Наклон этой линии изгибной жесткости клетки.
Discussion
Протокол, представленные здесь, предназначены для количественного измерения изгиба свойства бактериальных клеток. Эксперимент установка может быть применена к любому палочковидные элемент, который может быть сделан расти filamentously. Мы успешно использовали эту установку, чтобы исследовать последствия цитоскелета нитей на жесткость на изгиб Е. кишечной клетки. Эта же методика может быть использована для оценки роли давления, сотовые жесткость стен и других внутриклеточных компонентов в определении общей изгибной жесткости клеток.
Disclosures
Видео-продукции этой статьи был организован Безумный город Labs, которая производит инструменты, используемые в этих исследованиях.
Acknowledgments
Мы признаем, полезные советы от Mingzhai Солнца на обязательную клетки на поверхности. Мы благодарим Нед Wingreen и Земер Gitai за ценные обсуждения. Это исследование было поддержано Национальным институтом здоровья грант P50GM07150, Национальный научный фонд КАРЬЕРА награду PHY-0844466 и Альфреда Слоуна.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895-5G | |
| polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 181978-5G | |
| polylysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 0.5-μm-diameter polystyrene beads | Bangs Laboratories | PS03N | |
| Nano-LP Series nanopositioning system | Mad City Labs | NanoLP series | http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html |
References
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).
