Nematode Slide Forberedelse: En metode til at montere dyr på en Agar Pad

Overview

Under levende billeddannelse af C. eleganskan en agarosepude bruges til at holde nematoden stille uden at beskadige eller tørre den.  I denne video beskrives, hvordan du forbereder en simpel monteringspude til mikroskopi.

Protocol

Denne protokol er uddrag fra Teoh et al. Kvantitative tilgange til at studere cellulære strukturer og organellemorfologi i Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

Forberedelse af lysbilleder til billedbehandling

1. Forbered 3-4% m/ v agarose lager i en mikrobølgeovn-safe flaske (3-4 g i 100 mL ultrapure vand).
   BEMÆRK: Agar kan bruges i stedet for agarose i samme koncentration.
2. Smelt agarose omhyggeligt i en mikrobølgeovn, pas på ikke at koge for meget, indtil alle agarose opløses (klar opløsning). Opløsningen opbevares ved 70 °C for at forhindre størkning.
   BEMÆRK: Agarose lager kan bruges flere gange. Genopvarm før brug, hvis agarose er størknet.
3. Brug en Pasteur pipette, placere en dråbe smeltet agarose på et mikroskop dias.
   BEMÆRK: Undgå at have luftbobler i dråben af agar, da disse forstyrrer integriteten af puden.
4. Tryk straks agarosedråben ned med en anden mikroskoprutsjebane, og flad forsigtigt agarose i en pude mellem de to dias.
   BEMÆRK: Eventuelle rester bobler bør fjernes på dette tidspunkt. Hvis ikke, skal der laves nye dias, da dyr let kan sidde fast i boblerne. Undgå overløb af agar til siden, når du trykker på diaset.
5. Lad agarose tørre i 1 min.
6. Adskil forsigtigt de to dias for at undgå skader på agarose, mens du forlader den størknede pad på en af diasene.
   BEMÆRK: Rutsjebaner med agarose puder bør altid være forberedt frisk lige før eksperimentet, da de kan tørre ud. Sørg for, at agarosepuden har en ensartet tykkelse. Der bør ikke være luftbobler eller revner i puden, da dette kan forstyrre billeddannelsen.
7. Der tilsættes et lille fald (5-10 μL) på 0,05% tetramisolhydrochlorid (bedøvelsesmiddel) til midten af agarosepuden.
8. Ved hjælp af varmesteriliseret pick overføres hurtigt ca. 10 - 15 dyr fra lagerpladen til bedøvelsesdråben, før opløsningen tørrer ud. Undgå at overføre for meget OP50 bakterier, da dette gør opløsningen overskyet, hvilket kan forstyrre billeddannelsen.
   BEMÆRK: Hvis bedøvelsesopløsningen tørrer ud, mens du plukker, skal du blot pipette en anden dråbe på 0,05% tetramisolhydrochlorid på dyrene. Dyrene har tendens til at lægge på deres laterale side i bedøvelsesopløsningen.
9. Påfør en coverlip ved at placere den lige over agarose pad og forsigtigt slippe den ned. Dette vil forhindre dannelsen af bobler. Tryk ikke på dækslet, da dette kan knuse dyrene.
10. Mærk diasene med stammenavnet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G