Préparation de diapositives Nématode : Une méthode pour monter des animaux sur un tampon d’agar

Overview

Pendant l’imagerie en direct de C. elegans, un tampon d’agarose peut être utilisé pour maintenir le nématode encore sans l’endommager ou le sécher.  Cette vidéo décrit comment préparer une simple garniture de montage pour la microscopie.

Protocol

Ce protocole est extrait de Teoh et coll., Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

Préparation de diapositives pour l’imagerie

1. Préparer 3-4% w/v agarose stock dans une bouteille allant au micro-ondes (3-4 g dans 100 mL d’eau ultrapure).
   REMARQUE: L’agar peut être utilisé à la place de l’agarose à la même concentration.
2. Faire fondre soigneusement l’agarose dans un four à micro-ondes, en prenant soin de ne pas trop bouillir, jusqu’à ce que toute l’agarose se dissolve (solution claire). Gardez la solution à 70 °C pour éviter la solidification.
   REMARQUE: Le stock d’agarose peut être utilisé plusieurs fois. Réchauffer avant utilisation si l’agarose s’est solidifiée.
3. À l’aide d’une pipette Pasteur, déposer une goutte d’agarose fondue sur une lame de microscope.
   REMARQUE: Évitez d’avoir des bulles d’air dans la chute d’agar car celles-ci perturbent l’intégrité de la garniture.
4. Appuyez immédiatement sur la gouttelette agarose avec une autre lame de microscope, aplatissant doucement l’agarose dans un tampon entre les deux glissières.
   REMARQUE: Les restes de bulles doivent être enlevés à ce stade. Sinon, de nouvelles diapositives doivent être faites car les animaux peuvent facilement rester coincés dans les bulles. Évitez le débordement de l’agar sur le côté lorsque vous appuyez sur la lame.
5. Laisser sécher l’agarose pendant 1 min.
6. Séparez soigneusement les deux glissières pour éviter les dommages à l’agarose, tout en laissant la garniture solidifiée sur l’une des glissières.
   REMARQUE: Les toboggans avec des coussinets d’agarose doivent toujours être préparés frais juste avant l’expérience car ils peuvent sécher. Assurez-vous que la garniture d’agarose a une épaisseur cohérente. Il ne devrait pas y avoir de bulles d’air ou de fissures dans le tampon car cela peut interférer avec l’imagerie.
7. Ajouter une petite goutte (5-10 μL) d’hydrochlorure tétramisole (anesthésique) de 0,05 % au centre de la garniture d’agarose.
8. À l’aide d’un pic stérilisé à la chaleur, transférez rapidement environ 10 à 15 animaux de la plaque de bouillon à la gouttelette anesthésique avant que la solution ne se dessèche. Évitez de transférer trop de bactéries OP50 car cela rend la solution trouble, ce qui peut interférer avec l’imagerie.
   REMARQUE: Si la solution anesthésique sèche pendant la cueillette, il suffit de pipette une deuxième goutte de 0,05% hydrochlorure tétramisole sur les animaux. Les animaux ont tendance à se trouver sur leur côté latéral dans la solution anesthésique.
9. Appliquez un coverslip en le positionnant juste au-dessus de la garniture d’agarose et en le laissant tomber doucement vers le bas. Cela empêchera la formation de bulles. N’appliquez pas de pression sur le coverslip car cela peut écraser les animaux.
10. Étiquetez les diapositives avec le nom de la souche.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G