Preparação de slides de nematode: um método para montar animais em um agar pad

Overview

Durante a imagem ao vivo de C. elegans,uma almofada de agarose pode ser usada para segurar o nematoide ainda sem danificá-lo ou secá-lo.  Este vídeo descreve como preparar uma almofada de montagem simples para microscopia.

Protocol

Este protocolo é extraído de Teoh et al, Abordagens Quantitativas para Estudo de Estruturas Celulares e Morfologia organela em Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

Preparação de slides para imagem

1. Prepare 3-4% de caldo de agarose em uma garrafa segura para micro-ondas (3-4 g em 100 mL de água ultrauso).
   NOTA: Ágar pode ser usado no lugar de agarose na mesma concentração.
2. Derreta a agarose cuidadosamente em um forno de micro-ondas, tomando cuidado para não ferver sobre, até que toda a garose se dissolva (solução clara). Mantenha a solução a 70 °C para evitar a solidificação.
   NOTA: O estoque de agarose pode ser usado várias vezes. Reaqueça antes do uso se a agarose se solidificar.
3. Usando uma pipeta Pasteur, coloque uma gota de agarose derretida em um slide de microscópio.
   NOTA: Evite ter bolhas de ar na queda do ágar, pois estas perturbam a integridade do bloco.
4. Pressione imediatamente a gotícula de agarose com outro slide de microscópio, achatando suavemente a agarose em uma almofada entre os dois slides.
   NOTA: Quaisquer bolhas restantes devem ser removidas nesta fase. Se não, novos slides devem ser feitos, pois os animais podem facilmente ficar presos nas bolhas. Evite o transbordamento de ágar para o lado ao pressionar o slide.
5. Deixe a agarose secar por 1 min.
6. Separe cuidadosamente os dois slides para evitar danos à agarose, deixando a almofada solidificada em um dos slides.
   NOTA: Slides com almofadas de agarose devem ser sempre preparados frescos pouco antes do experimento, pois eles podem secar. Certifique-se de que a almofada de agarose tenha uma espessura consistente. Não deve haver bolhas de ar ou rachaduras no bloco, pois isso pode interferir com a imagem.
7. Adicione uma pequena gota (5-10 μL) de 0,05% de cloridrato de tetramisole (anestésico) ao centro da almofada de agarose.
8. Usando a picareta esterilizada a calor, transfira rapidamente cerca de 10 a 15 animais da placa de estoque para a gota anestésico antes que a solução seque. Evite transferir muitas bactérias OP50, pois isso torna a solução turva, o que pode interferir com a imagem.
   NOTA: Se a solução anestésico secar durante a colheita, basta pipeta uma segunda gota de 0,05% de cloridrato de tetramisole sobre os animais. Os animais tendem a deitar em seu lado lateral na solução anestésico.
9. Aplique uma mancha de cobertura posicionando-a logo acima da almofada de agarose e gentilmente deixando-a cair. Isso impedirá a formação de bolhas. Não aplique pressão no deslizamento, pois isso pode esmagar os animais.
10. Rotule os slides com o nome da tensão.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G