Нематод Слайд Подготовка: Метод конировать животных на Агар-Пад

Overview

Во время живой визуализации C. elegans, агароза площадку можно использовать для времени нематод еще без повреждения или сушки его.  Это видео описывает, как подготовить простую монтажную площадку для микроскопии.

Protocol

Этот протокол выдержки из Teoh et al, Количественные подходы для изучения клеточных структур и органеллы морфологии в Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

Подготовка слайдов для визуализации

1. Приготовьте 3-4% ж/в агарозный бульон в микроволново-безопасной бутылке (3-4 г в 100 мл ультрапурной воды).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Агар может быть использован вместо агарозы в той же концентрации.
2. Растопить агарозу тщательно в микроволновой печи, заботясь о том, чтобы не закипеть, пока вся агароза не растворится (ясный раствор). Держите раствор на уровне 70 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить затвердевание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Запас агарозы можно использовать несколько раз. Разогреть перед использованием, если агароза затвердевла.
3. Используя пипетку Pasteur, поместите каплю расплавленной агарозы на слайд микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пузырьков воздуха в капле агара, поскольку они нарушают целостность колодки.
4. Немедленно нажмите вниз капли агарозы с другой слайд микроскопа, мягко уплощение агарозы в площадку между двумя слайдами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любые оставшиеся пузырьки должны быть удалены на данном этапе. Если нет, то новые слайды должны быть сделаны, как животные могут легко застрять в пузырьках. Избегайте переполнения агара в сторону при нажатии на слайд.
5. Оставьте агарозу высохнуть в течение 1 мин.
6. Тщательно разделите два слайда, чтобы избежать повреждения агарозы, оставляя затвердевую площадку на одном из слайдов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды с агарозой колодки всегда должны быть подготовлены свежие перед экспериментом, как они могут высохнуть. Убедитесь, что агарозная подушечку имеет последовательную толщину. Там не должно быть пузырьков воздуха или трещин в площадку, как это может помешать изображений.
7. Добавьте небольшую каплю (5-10 МКЛ) 0,05% тетрамизола гидрохлорид (анестетик) в центр агарозной площадки.
8. Используя теплостерилизуемый выбор, быстро перенесите от 10 до 15 животных из фондовой тарелки в обезболивающее падение, прежде чем раствор высохнет. Избегайте передачи слишком много бактерий OP50, как это делает решение облачно, что может помешать визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если обезболивающее раствор высыхает во время сбора, просто пипетка второй капли 0,05% тетрамизола гидрохлорид на животных. Звери, как правило, лежат на боковой стороне в обезболивающем растворе.
9. Нанесите крышку, располагая ее чуть выше агарозной площадки и аккуратно опустив ее вниз. Это предотвратит образование пузырьков. Не надавите на крышку, так как это может раздавить животных.
10. Наклеить слайды с именем деформации.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G