Preparación de diapositivas de nematodo: un método para montar animales en una almohadilla de agar

Overview

Durante las imágenes en vivo de C. elegans,se puede utilizar una almohadilla de agarose para mantener el nematodo quieto sin dañarlo ni secarlo.  Este video describe cómo preparar una almohadilla de montaje simple para microscopía.

Protocol

Este protocolo se extrae de Teoh et al, Enfoques cuantitativos para el estudio de estructuras celulares y morfología de Orgánulo en Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

Preparación de diapositivas para imágenes

1. Preparar 3-4% de stock de agarose w/v en una botella apto para microondas (3-4 g en 100 ml de agua ultrapura).
   NOTA: Agar se puede utilizar en lugar de agarose en la misma concentración.
2. Derretir la agarose cuidadosamente en un horno microondas, teniendo cuidado de no hervir en exceso, hasta que toda la agarose se disuelva (solución transparente). Mantenga la solución a 70 °C para evitar la solidificación.
   NOTA: El stock de Agarose se puede utilizar varias veces. Recaliente antes de su uso si la agarose se ha solidificado.
3. Con una pipeta Pasteur, coloque una gota de agarose derretida en una diapositiva del microscopio.
   NOTA: Evite tener burbujas de aire en la caída del agar, ya que éstas interrumpen la integridad de la almohadilla.
4. Presione inmediatamente hacia abajo la gota de agarose con otra diapositiva del microscopio, aplanando suavemente la agarose en una almohadilla entre las dos diapositivas.
   NOTA: Las burbujas sobrantes deben eliminarse en esta etapa. Si no es así, se deben hacer nuevas diapositivas, ya que los animales pueden quedar atrapados fácilmente en las burbujas. Evite el desbordamiento del agar hacia un lado al presionar la diapositiva.
5. Deje que la agarose se seque durante 1 min.
6. Separe cuidadosamente las dos diapositivas para evitar daños en la agarose, mientras deja la almohadilla solidificada en una de las diapositivas.
   NOTA: Los toboganes con almohadillas de agarose siempre deben prepararse frescos justo antes del experimento, ya que pueden secarse. Asegúrese de que la almohadilla de agarose tenga un grosor constante. No debe haber burbujas de aire o grietas en la almohadilla, ya que esto puede interferir con las imágenes.
7. Agregue una pequeña gota (5-10 μL) de clorhidrato de tetramisole (anestésico) al centro de la almohadilla de agarose.
8. Usando pico esterilizado térmicamente, transfiera rápidamente entre 10 y 15 animales de la placa de caldo a la gota anestésica antes de que la solución se seque. Evite transferir demasiadas bacterias OP50, ya que esto hace que la solución sea turbia, lo que puede interferir con las imágenes.
   NOTA: Si la solución anestésica se seca mientras se recoge, simplemente canalice una segunda gota de clorhidrato de tetramisole al 0,05% sobre los animales. Los animales tienden a ponerse en su lado lateral en la solución anestésica.
9. Aplique un control de cubierta colocándolo justo encima de la almohadilla de agarose y soltándolo suavemente hacia abajo. Esto evitará la formación de burbujas. No aplique presión a la mancha, ya que esto puede aplastar a los animales.
10. Etiquete las diapositivas con el nombre de la distensión.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G