Overview
يصف هذا الفيديو تقنية لفحص النيماتودا المفرد بسرعة للحصول على علامة جينية عن طريق فحص PCR. في بروتوكول المثال ، نقوم بفحص تحرير الجينوم القائم على CRISPR.
Protocol
البروتوكول التالي هو مقتطف من Prior et al, خط أنابيب سريع وسهل لتوليد المسوخ نقطة الجينوم في C. elegans باستخدام CRISPR/Cas9 ريبونوكليوبروتس, J. Vis. Exp. (2018).
دودة واحدة PCR و جينوتيبينج
- بعد 1 - 2 أيام من وضع البيض، ونقل F1ق في قبعات أنبوب الشريط PCR الفردية التي تحتوي على 7 ميكرولتر من دودة تحلل العازلة باستخدام معول دودة (الجدول 1، الشكل 1D، اليوم 4 - 5).
- أنابيب الطرد المركزي PCR بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة لجلب الحيوانات إلى قاع الأنبوب، وتجميد الأنابيب في -80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
ملاحظة: يمكن تخزين الديدان عند -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. - الديدان المجمدة ليس في thermocycler باستخدام البرنامج التالي: 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، 4 درجة مئوية عقد.
- إعداد PCR mastermix كما هو موضح في الجدول 2.
- أضف 21 ميكرولتر من PCR mastermix إلى أنابيب PCR نظيفة، ثم أضف 4 ميكرولتر من تحلل الدودة من الخطوة 3. مزيج جيدا باستخدام ماصة وتشغيل برنامج PCR باتباع المبادئ التوجيهية المصنعين (انظر جدول المواد).
- تنقية تفاعلات PCR باستخدام مجموعة أدوات تنظيف وتركيز الحمض النووي ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). الحمض النووي Elute بإضافة 10 ميكرولتر من الماء إلى عمود الدوران.
- إعداد تقييد إنزيم mastermix كما هو مبين في الجدول 3.
- إضافة 10 ميكرولتر من mastermix إنزيم تقييد لكل تفاعل PCR تنظيفها واحتضان لمدة 1-2 ساعة في 37 درجة مئوية.
- منفصلة هضم منتجات PCR على هلام agarose 1.5٪ تشغيل في 120 V باستخدام 1x تريس خلات-EDTA (TAE) العازلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام التي يمكن أن هندسة CRISPR-Cas9 منموقعC. eleganssod-1. (أ)رسم تخطيطي يصور بنية exon-intron للجراد sod-1 في C. elegans. يشير الشريط الأحمر إلى موقع G93 في exon 3. تتم الإشارة إلى مجموعة زوج التمهيدي بواسطة الأسهم الحمراء (F1-R1). (ب)تسلسل محاذاة الإنسان وC. elegans (دودة) البروتينات SOD-1. يتم تمييز بقايا G93 المستهدفة باللون الأحمر. (ج) أعلى, يظهر قسم من الحمض النووي الجينومي المحيطة codon G93 كمرجع, ويتم تسليط الضوء على PAM (الأخضر) وsgRNA الهدف (الأزرق) المواقع. أسفل، واحد الذين تقطعت بهم السبل oligonucleotide (ssODN) homology إصلاح الموجهة (HDR) يظهر قالب يحتوي على : تحرير كودون تغيير G93 إلى A93 ، وتغيير صامت إلى عزر PAM لمنع الانقسام من قبل مجمع SgRNA - Cas9 ، تغيير صامت لإدخال فريدة من نوعها HindIII تقييد موقع الانزيم (مربع أصفر) ، ويحيط 5 ' و 3 ' 50 bp homology الأسلحة (القضبان السوداء). يتم تمييز جميع التغييرات النيوكليوتيدات المصممة في ssODN الأحمر. (D) رسم تخطيطي لخط أنابيب لتوليد وتحديد CRISPR-Cas9 المسوخ نقطة RNP المستندة. في اليوم 0، حقن 10 - 15 ف0 الحيوانات مع مزيج الحقن. في اليوم 2 - 3 ، حدد الحيوانات التي تم حقنها بنجاح P0 من قبل تلك التي تحتوي على ذرية الفلورسنت F1 ، وحدد ثلاث لوحات P0 مع ذرية الفلورسنت الأكثر. من كل من لوحات P0 الثلاثة، واحد 8 الفلورسنت F1 ذرية. في اليوم 4 - 5 ، (أ) الخطوة 1 ، يتم اختيار الفرد F1s ووضعها في أنابيب PCR التي تحتوي على Lysis Buffer ؛ (ب) الخطوة 2، بعد التجميد عند درجة حرارة -80 درجة مئوية، يتم تحليل أنابيب PCR التي تحتوي على ديدان F1 لإطلاق الحمض النووي الجينومي، الذي يستخدم كقالب PCR. ثم يتم تنظيف منتجات PCR وهضمها مع إنزيم تقييد فريد من نوعه. (ج) الخطوة 3، يتم حل المنتجات المهضومة الإنزيم على هلام الآغاروز حيث يمكن تحديد نوع البرية (+/+)، heterozygous (م / +)، والحيوانات homozygous (م / م) عن طريق تقييد أنماط هضم النطاقات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الكاشف | [النهائي] |
| KCl | 50 مليون متر |
| تريس-HCl pH 8.3 | 10 mM |
| MgCl2 | 2.5 مليون متر |
| NP-40 | 0.45% |
| توين-20 | 0.45% |
| بروتيناز K | 1 ملغم/مل |
الجدول 1 - الجداول دودة تحلل وصفة المخزن المؤقت. يجب إضافة البروتين K الطازجة قبل كل استخدام.
| الكاشف | 1x | 24x |
| 2X Q5 ماسترميكس | 12.5 ميكرولتر | 300 ميكرولتر |
| التمهيدي F1 (10 ميكرومتر) | 1.25 ميكرولتر | 30 ميكرولتر |
| التمهيدي R1 (10 ميكرومتر) | 1.25 ميكرولتر | 30 ميكرولتر |
| تحلل الدودة | 4 ميكرولتر | ---- |
| ddH2O | 6 ميكرولتر | 144 ميكرولتر |
| وحدة التخزين النهائية | 25 ميكرولتر | 504 ميكرولتر |
الجدول 2 - الأرباح PCR ماسترميكس. يجب أن يتم خلط mastermix PCR بشكل جيد عن طريق pipetting حتى الحل متجانسة. وينبغي إضافة 21 ميكرولتر من ماسترميكس PCR لتنظيف أنابيب PCR، ومن ثم 4 ميكرولتر من lysate دودة الفردية ينبغي أن تضاف إلى أنابيب المسمى بشكل صحيح.
| الكاشف | 1x | 24x |
| 10X إنزيم العازلة | 2 ميكرولتر | 48 ميكرولتر |
| تنظيف تفاعل PCR | 10 ميكرولتر | ---- |
| ddH2O | 7 ميكرولتر | 168 ميكرولتر |
| تقييد الإنزيم (10 U/μL) | 1 ميكرولتر | 24 ميكرولتر |
| وحدة التخزين النهائية | 20 ميكرولتر | 240 ميكرولتر |
الجدول 3 - الأرباح تقييد إنزيم ماسترميكس. وينبغي خلط مادميكس إنزيم تقييد جيدا عن طريق pipetting حتى الحل متجانسة. وينبغي إضافة 10 ميكرولتر من مادميكس إنزيم تقييد إلى 10 ميكرولتر من المنتج PCR تنظيفها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
