Single Worm PCR: een methode om genomisch DNA te extraheren en te versterken

Overview

Deze video beschrijft een techniek om een enkel nematode snel te screenen op een genetische marker door PCR-screening. In het voorbeeldprotocol screenen we op CRISPR-gebaseerde genoombewerking.

Protocol

Het volgende protocol is een uittreksel uit Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).

Single Worm PCR en Genotypering

1. Breng na 1 - 2 dagen leggen de F₁s over in individuele PCR-stripbuisdoppen met 7 μL wormlysisbuffer met behulp van een wormpluk(tabel 1, figuur 1D,dag 4 - 5).
2. Centrifugeer PCR-buizen op maximale snelheid gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur om dieren naar de buisbodem te brengen en vries buizen bij -80 °C gedurende 1 uur.
   OPMERKING: Wormen kunnen voor onbepaalde tijd bij -80 °C worden bewaard.
3. Lyse bevroren wormen in een thermocycler met behulp van het volgende programma: 60 °C gedurende 60 min, 95 °C gedurende 15 min, 4 °C hold.
4. Pcr mastermix instellen zoals weergegeven in tabel 2.
5. Voeg 21 μL PCR-mastermix toe aan schone PCR-buizen en voeg vervolgens 4 μL wormlyse toe vanaf stap 3. Meng goed met behulp van een pipet en voer het PCR-programma uit volgens de richtlijnen van de fabrikant (zie materialentabel).
6. Zuiver PCR-reacties met behulp van een DNA Clean and Concentrate-kit, volgens de instructies van de fabrikant (zie materialentabel). Elute DNA door 10 μL water toe te voegen aan de spinkolom.
7. Opstelling beperking enzym mastermix zoals weergegeven in tabel 3.
8. Voeg 10 μL van het restrictie-enzym mastermix toe aan elke gereinigde PCR-reactie en incubeer gedurende 1 - 2 uur bij 37 °C.
9. Afzonderlijke verteerde PCR-producten op een 1,5% agarosegel lopen op 120 V met behulp van 1x Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer.

Representative Results

Figuur 1. CRISPR-Cas9 engineering van deC. eleganssod-1 locus. (A) Schematische illustratie die de exon-intronstructuur van de zode-1 locus in C. elegans afschildert. De rode balk geeft de locatie van G93 in exon 3 aan. De primer paar set wordt opgemerkt door de rode pijlen (F1-R1). (B) Sequentie uitlijning van menselijke en C. elegans (worm) SOD-1 eiwitten. Het beoogde G93-residu is rood gemarkeerd. (C) Bovenaanwordt een deel van genomisch DNA rond de G93-codon weergegeven als referentie en worden de PAM(groene) en sgRNA-doellocaties (blauw) gemarkeerd. Onder, de single stranded oligonucleotide (ssODN) homologie gerichte reparatie (HDR) sjabloon wordt weergegeven met daarin: de codon bewerken veranderen G93 naar A93, een stille verandering in het PAM motief om decolleté door de sgRNA-Cas9 complex te voorkomen, een stille verandering om een unieke HindIII beperking enzym site (gele doos) te introduceren, en flankeren 5 ' en 3 ' 50 bp homologie armen (zwarte balken). Alle nucleotideveranderingen die in de ssODN zijn ontworpen, zijn rood gemarkeerd. (D) Schematische illustratie van de pijpleiding voor het genereren en identificeren van CRISPR-Cas9 RNP-gebaseerde puntmutanten. Injecteer op dag 0 10 - 15 P₀ dieren met injectiemix. Identificeer op dag 2 - 3 met succes geïnjecteerde P_0-dieren door dieren die fluorescerend F_1-nageslacht bevatten en selecteer drie P_0-platen met het meest fluorescerende nageslacht. Van elk van de drie P_0-platen, enkele 8 fluorescerende F_{1-nakomelingen.} Op dag 4 - 5, (a) stap 1, worden individuele F₁s geplukt en in PCR-buizen geplaatst die Lysis Buffer bevatten; b) stap 2, na bevriezing bij -80 °C, worden PCR-buizen met F_1-wormen gelysed om genomisch DNA vrij te geven, dat wordt gebruikt als EEN PCR-sjabloon. De PCR-producten worden vervolgens gereinigd en verteerd met het unieke restrictie-enzym; c) stap 3, enzymverteerd producten worden opgelost op een agarosegel waarbij wilde (+/+), heterozygote (m/+) en homozygote (m/m) dieren kunnen worden geïdentificeerd door beperking van de verteringsbandingspatronen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 

Reagens	[Definitief]
Kcl	50 mM
Tris-HCl pH 8,3	10 mM
MgCl2	2,5 mM
NP-40	0.45%
Tween-20	0.45%
Proteïnase K	1 mg/ml

Tabel 1. Worm Lysis Buffer Recept. Proteïnase K moet voor elk gebruik vers worden toegevoegd.

Reagens	1x	24x
2x Q5 Mastermix	12,5 μL	300 μL
Primer F1 (10 μM)	1,25 μL	30 μL
Primer R1 (10 μM)	1,25 μL	30 μL
Worm Lysis	4 μL	----
ddH2O	6 μL	144 μL
Definitief volume	25 μL	504 μL

Tabel 2. PCR Mastermix. De PCR mastermix moet goed worden gemengd door pipetten totdat de oplossing homogeen is. 21 μL van de PCR-mastermix moet worden toegevoegd aan schone PCR-buizen en vervolgens moet 4 μL individueel wormlysaat worden toegevoegd aan naar behoren gelabelde buizen.

Reagens	1x	24x
10x enzymbuffer	2 μL	48 μL
Gereinigde PCR-reactie	10 μL	----
ddH2O	7 μL	168 μL
Beperking Enzym (10 U/μL)	1 μL	24 μL
Definitief volume	20 μL	240 μL

Tabel 3. Beperking Enzym Mastermix. Het restrictie-enzym mastermix moet goed worden gemengd door pipetten totdat de oplossing homogeen is. 10 μL van het restrictie-enzym mastermix moet worden toegevoegd aan 10 μL gereinigd PCR-product.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nuclease-free water	Synthego Inc.	provided with the sgRNA kit EZ kit
KCl	Sigma	P5405
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4004
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0494L
Proteinase K	Sigma	P2308
MgCl2	Sigma	M2393
NP-40	Sigma	74385
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
RNaseZap Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780