Summary
Retina damar sisteminin oksidatif stres ve sitokinler gibi diyabet/diyabetik retinopati ile ilişkili hakaretlerden ölüme karşı direncini izlemek için bir koruma testi geliştirilmiştir.
Abstract
Diyabetik retinopati (DR), patogenezinde iki farklı evre ile karakterize kompleks ve ilerleyici bir oküler hastalıktır. İlk aşama, retinada diyabetin neden olduğu hasardan korunma kaybını içerirken, ikinci aşama bu hasarın birikmesine odaklanır. Geleneksel tahliller öncelikle, hasarın ciddiyetinin göstergesi olan kılcal dejenerasyonu değerlendirmeye odaklanır ve esasen DR'nin ikinci aşamasını ele alır. Bununla birlikte, retina damar sisteminin koruyucu mekanizmalarının tehlikeye girip girmediğine dair yalnızca dolaylı olarak fikir verirler. Bu sınırlamayı ele almak için, retinanın koruyucu mekanizmalarını, özellikle de oksidatif stres ve sitokinler gibi diyabetin neden olduğu hakaretlere karşı direncini doğrudan değerlendirmek için yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir. Bu koruma testi, başlangıçta diyabetik retinopati için tasarlanmış olmasına rağmen, hem fizyolojik hem de patolojik bağlamlarda daha geniş uygulamalar için potansiyele sahiptir. Özetle, diyabetik retinopatinin patogenezini anlamak, araştırma için değerli bir araç sunan ve potansiyel olarak diğer tıbbi durumlara kadar uzanan bu yenilikçi koruma testi ile koruma kaybı ve hasar birikiminin ikili aşamasını tanımayı içerir.
Introduction
Diyabetik retinopati (DR), diabetes mellitusun (DM) mikrovasküler komplikasyonlarından biridir ve gelişmiş ülkelerde çalışma çağındaki bireylerde körlüğün önde gelen nedenidir1. Diyabetik retinopati için majör risk faktörleri hipergliseminin süresi ve derecesidir 2,3,4. DM, retinanın hem vasküler hem de nöral komponentlerinde disfonksiyona nedenolurken5, DR tanısı retina vaskülatürününmorfolojik özelliklerine dayanır 6.
Hiperglisemiye bağlı oksidatif stres, DR patogenezinin itici güçlerinden biridir7. Artan oksidatif stres, mitokondrinin işlevselliğini tehlikeye atan ve böylece reaktif oksijen türlerinin seviyesini daha da artıran yaygın hasara neden olur. Bu olaylara retina damarlarının sızması, inflamatuar sitokinlerin seviyesinde bir artış ve retina içindeki hem nöral hem de vasküler hücre tiplerinin ölümü eşlik eder. Vasküler hücrelerin kaybı ve dolayısıyla retinanın geniş kılcal ağının işlevselliği, çeşitli yanıtlar için güçlü bir uyaran olan hipoksi ile sonuçlanır5. Bu tür yanıtlar, hem geçirgenliği hem de anjiyogenezi yönlendiren vasküler endotelyal büyüme faktörünün (VEGF) artmış ekspresyonunu, DR - diyabetik makula ödeminin ileri, görmeyi tehdit eden aşamalarının kardinal özelliklerini ve proliferatif diyabetik retinopatiyiiçerir 6.
DR'nin bazı özellikleri, bir organizmanın (hem hastalar hem de deney hayvanları) bu endikasyona direnmek için içsel bir yeteneğe sahip olduğunu göstermektedir. Hastalar, görmeyi tehdit eden DR 8,9,10,11,12,13 geliştirmeden önce birkaç on yıl DM yaşarlar. DM'nin kemirgen modelleri DR14'ün ileri, görmeyi tehdit eden aşamalarını geliştirmezken, ortaya çıkan DR'nin başlangıç/hafif formu bunu ancak haftalar veya aylar süren DM15,16'dan sonra yapar. Ayrıca, hem hastalarda hem de deney hayvanlarında DR ilerleyicidir ve DM süresi uzadıkça retina disfonksiyonu/hasarı artar. Son olarak, DM'li bazı hastalarda hiçbir zaman DR gelişmez. Bazı durumlarda, bunun nedeni, bu tür bireylerin DR'nin gelişmesi için yeterince uzun süre diyabet yaşamamasıdır. Diğer durumlarda, bunun nedeni DR'ye karşı olağanüstü direnç göstermeleridir; 50 veya daha fazla yıllık DM17'den sonra DR geliştirmeyen Medalist çalışmasının katılımcılarında olduğu gibi. DR'den korumanın varlığına ve muazzam translasyonel alaka düzeyine yönelik bu kadar zorlayıcı desteğe rağmen, korumanın altında yatan mekanizma agresif bir şekilde araştırılmamıştır.
Burada açıklanan koruma testi, diyabetik farelerde DR'nin DM başlangıcından neden geciktiğinin araştırılmasını kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. DM ve DM olmayan farelere uygulanan bu testin temel adımları şunları içerir: (1) göze sub-maksimal ölüme neden olan bir hakaret (ex vivo veya in vivo), (2) retinal damar sistemini izole etmek, (3) damar sistemini TUNEL ve DAPI ile boyamak, (4) elde edilen görüntülerin fotoğraflanması ve TUNEL/DAPI çift pozitif türlerin yüzdesinin ölçülmesi.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları, Chicago'daki Illinois Üniversitesi'ndeki Hayvan Bakımı ve Kurumsal Biyogüvenlik Ofisi tarafından onaylanmıştır. Yedi haftalık erkek C57 / BL6 / J fareleri, 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde patojen içermeyen bir ortamda grup kafeslerine yerleştirildi ve ücretsiz yiyecek ve su erişimi sağlandı. Farelere CO2 asfiksiyonu ile ötenazi yapıldı ve gözler hemen enüklee edildi ve işlendi18. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Çalışma için gerekli olan temel araçlar Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Ölüme neden olan hakaretin iletilmesi
- TBH (ex vivo) ile oksidatif stres uygulayın.
- Kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek farelere ötenazi yapın ve gözlerinienüklee edin 18 (Şekil 2A).
- Gözbebeklerini doğrudan 5 mM Tert-bütil hidroperoksit (TBH) ile veya olmadan DMEM +% 1 BSA içeren 24 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına koyun (bkz. 37 °C'de 1 saat inkübe edin. Pozitif bir kontrol numunesi, DNA'yı parçalamak için 10 dakika boyunca DNaz (50 U / 100 μL) ile muamele edilir.
NOT: TBH dozu (oksidatif stresi indükleyen ajan), izole retina damarları18 içinde kolayca saptanabilir ve sub-maksimal bir hücre ölümü seviyesini indüklemek için seçilmiştir. - Gözleri gece boyunca% 10 tamponlu formalin ile sabitleyin (en az 16 saat).
- Enflamasyonu indüklemek için sitokin kokteyli kullanın (in vivo).
- Fareleri 100 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun.
- Sitokin kokteylinin 1 μL/gözünü vitreusa enjekte etmek için özelleştirilmiş bir 33 G iğne ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın; enjeksiyon bölgesi limbustan 2-3 mm uzaklıktadır (Şekil 2B).
NOT: Sitokin kokteyli, 1 μg/mL TNF-α, 1 μg/mL IL-1β ve 1500 U/μL IFN-γ18'in 1:1:1 oranını içerir (bkz. - Enjeksiyondan 24 saat sonra, farelere ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek), gözlerini enüklee edin ve gece boyunca% 10 tamponlu formalin ile sabitleyin.
NOT: Deneme, sabitlemeden sonra en fazla 1 hafta duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başlatılabilir.
2. Retina izolasyonu
- Göz küresini kesip açın.
- Optik siniri nazikçe tutmak için düz forseps kullanın (Şekil 2C). Limbusun arkasında 2-3 mm'lik bir kesi yapmak için diğer elinizle bir mikro bıçak tutun.
- Göz küresi iki yarıya bölünene kadar göz küresini optik sinirle birlikte döndürürken limbusa paralel kesmek için mikro bıçaktan mikro makasa geçin.
- Lens de dahil olmak üzere gözün ön yarısını atın (Şekil 2C).
- Sklerayı çıkarın.
- Sklerayı retinadan 1-3 mm uzağa nazikçe kaldırmak için düz forseps kullanın.
- Optik sinire giden sklera kısmında iki radyal kesim yapmak için mikro makas kullanın. Alttaki retinayı kesmekten kaçının.
- Skleral flebi tutmak ve retinadan koparmak için bir çift kavisli forseps kullanın. RPE tabakası sklera ile birlikte çıkacaktır.
- Retinayı yıka.
- İzole retinayı, çift damıtılmış suyla doldurulmuş 24 oyuklu bir tabak içindeki bir kuyuya aktarmak için bir mikro spatula kullanın.
- Çanağı oda sıcaklığında orta-orta hızda hafifçe sallayın. Suyu her 30 dakikada bir 1 saatte, en az 4-5 kez değiştirin, ardından gece boyunca bırakın.
3. Retina damar sistemi izolasyonu
- Sindirim: Çift damıtılmış suyu 800 μL YL tripsin çözeltisi (0,1 M Tris tamponunda (pH 7,8)) %3 tripsin) ile değiştirin. 37 ° C'de 4 saat 15 dakika19 boyunca hafifçe çalkalayarak veya çalkalamadan inkübe edin (Şekil 2D).
NOT: Damar sistemine zarar verebileceğinden hızlı sallamaktan kaçının. - Transfer: Retinayı tüy bırakmayan, çift damıtılmış su içeren 35 mm'lik bir Petri kabına aktarmak için bir cam transfer pipetinin geniş ucunu YL tripsin çözeltisine batırın.
- Dış nükleer tabakayı (fotoreseptörler) çıkarın (Şekil 2E).
- Retina yarı küresini aşağı bakacak şekilde çevirin. Retinayı tabağın dibine hafifçe bastırmak için düz tek saç fırçasını kullanın.
- Retinanın fotoreseptörlerini nazikçe fırçalamak için döngü fırçasını kullanın. Fırça darbeleri, optik sinirden retinanın çevresine doğru bir yönde uygulanır. Fotoreseptörler, retinanın geri kalanına kan damarları tarafından tutturulmadıkları için büyük tabakalar halinde ayrılabilirler.
- Nöral doku tabakalarını toplamak ve atmak için 200 μL'lik bir pipet kullanmak.
- Vitreusu çıkarın.
- Retina yarı küresini yukarı bakacak şekilde çevirin. Vitreusu diseksiyon mikroskobu altında mümkün olduğunca kavramak için bir çift kavisli forseps (A) kullanın.
NOT: Vitreus, optik sinire veya retinaya bağlı şeffaf bir doku tabakası gibi görünür. - Vitreusun optik siniri bağladığı ucunu kavramak için başka bir kavisli forseps (B) kullanın. Forseps A'yı forseps B'den uzağa çekerek vitreusu çıkarın.
- Vitreusu atın. Vitreus kalıntısını inceleyin ve kalıntı sonraki adımları engelleyeceğinden tüm vitreusu çıkarmak için bu adımı tekrarlayın.
- Retina yarı küresini yukarı bakacak şekilde çevirin. Vitreusu diseksiyon mikroskobu altında mümkün olduğunca kavramak için bir çift kavisli forseps (A) kullanın.
- Kalan nöral ve glial dokuyu çıkarın (Şekil 2F).
- Retina yarı küresini tekrar aşağı bakacak şekilde çevirin. Bir kez daha, retinayı tabağın dibine hafifçe bastırmak için düz fırçayı kullanın (saçın ucunu kullanmayın).
- Kalan sinir dokusunu çıkarmak için optik sinir başından çevreye doğru damar sistemini nazikçe fırçalamak için halka fırçasını kullanın20.
- Retinayı düz fırça ile yavaşça döndürün ve damar ağı iyice temizlenene kadar retina damar sistemi üzerindeki tüm küçük sinir dokusu parçalarını çıkarmak için halka fırçasını kullanın (Şekil 2G, H).
4. İzole retina damar sisteminin mikroskop lamı üzerine monte edilmesi
- Bir mikroskop lamı yerleştirin.
- Diseksiyon mikroskobu altında temiz bir montaj kaseti (Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin. Kaseti çift damıtılmış suyla doldurun.
- Aydınlatılmış şeffaf damar sistemini görmek için kontrast oluşturmaya yardımcı olmak için diseksiyon mikroskobu altında siyah bir arka plan kullanın.
- Montaj kasetinin altına temiz, etiketli bir mikroskop lamı yerleştirmek için forseps kullanın.
- Retina damar sistemini aktarın.
- Bir cam transfer pipetinin geniş ucunu YL tripsin çözeltisine batırın.
- Temizlenmiş retina damar sistemini aktarın ve damar sistemini montaj kaseti içindeki ve mikroskop lamının üzerindeki çift damıtılmış suya nazikçe çıkarın.
- Retina damar sistemini monte edin.
NOT: Damar sistemi mikroskop lamının üzerinde yüzerken, izole edilen damar sistemi normal kase şeklini alacaktır.- Retina yarı küresini yukarı bakacak şekilde çevirmek için halka fırçasını kullanın ve damar sistemini yavaşça cam slaytın üzerine itin ve ardından açılan damar sistemini slaydın ortasına yapıştırmak için saçı kullanın. Damar sistemi dokundukça slayta yapışmalıdır.
- Çanak şeklindeki retina damarını optik sinirden çevreye doğru fırçalayarak damar sistemini düz bir şekilde monte edin.
- Damar sistemi slayta tamamen yapışana kadar her yöne fırçalamayı tekrarlayın.
- Retina damar sistemini havayla kurutun.
- Tüm retina damar sistemi slayta yapıştıktan sonra, akıntıları en aza indirmek için bir kenarını hafifçe kaldırarak veya kasetin köşesindeki suyu yavaşça boşaltarak ve ardından dışarı çekerek slaytı sudan çıkarın (Şekil 2I).
NOT: Damar sistemi, havayla kurutulduktan sonra kolayca görünür hale gelecektir (Şekil 2J). - Slaydın arkasındaki retina damar sisteminin çevresini bir işaretleyici kalemle işaretleyin.
- Numuneyi duraklamadan boyamaya devam edin.
- Tüm retina damar sistemi slayta yapıştıktan sonra, akıntıları en aza indirmek için bir kenarını hafifçe kaldırarak veya kasetin köşesindeki suyu yavaşça boşaltarak ve ardından dışarı çekerek slaytı sudan çıkarın (Şekil 2I).
5. TUNEL boyama ile ölüm tespiti
NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için Zheng ve ark.21'e bakın. İzole retina damarlarında iskemi +/- öküz stresine bağlı apoptotik cisimlerin temsili görüntüleri Şekil 3'te gösterilmektedir.
- İzole edilmiş damar sistemini PBS ile rehidrate edin. PBS'de 3 kez durulayın ve daha sonra izole edilmiş damar sistemine nüfuz etmek için PBS'de% 1 Triton X-100 ile buz üzerinde 2 dakika inkübe edin.
- Kalan Triton X-100'ü çıkarmak için slaytları PBS ile iki kez durulayın. Numunenin etrafındaki alanı kurutun.
- Numuneye 50 μL TUNEL reaksiyon karışımı (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Slaytı nemli bir atmosferde karanlıkta 37 °C'de 60 dakika inkübe edin.
- TUNEL reaksiyon karışımını çıkarmak için slaytı PBS ile 3 kez durulayın. Numunenin etrafındaki alanı kurutun.
- Çekirdekleri DAPI ile boyamak için bir damla DAPI montaj ortamı ekleyin ve numuneyi bir kapak camı ile monte edin. Karanlıkta 4 °C'de saklayın.
NOT: Görüntü yakalamadan önce protokol 1 haftaya kadar duraklatılabilir. - Elde edilen damar sistemini konfokal floresan mikroskobu ile fotoğraflayın (bkz. Optik siniri çevreleyen uzak çevrede rastgele seçilen altı ila sekiz alanı yakalayın (Şekil 4).
NOT: İzole retina damarlarında sitokin kaynaklı apoptotik cisimlerin temsili görüntüleri Şekil 5'te gösterilmektedir. - Sonuçları analiz edin.
- Ex vivo, TBH ile muamele edilmiş numuneler için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- Resim J'yi kullanarak her alandaki apoptotik cisimlerin (TUNEL/DAPI çift pozitif türler) sayısını sayın (bkz. Tek bir numunenin tüm alanlarındaki apoptotik cisimlerin ortalamasını hesaplayın.
- Rastgele seçilen bir çift DM dışı ve DM örneği arasındaki apoptotik cisimlerin sayısındaki kat değişimini hesaplayın.
- İki kuyruklu öğrenci t-testi18 kullanarak istatistiksel olarak anlamlı bir fark olup olmadığını belirleyin.
NOT: Kontrol ve deney numunelerini (DM ve DM olmayan) aynı vesileyle boyayın çünkü TUNEL boyamanın kapsamı aynı şekilde yapıldığında bile değişebilir. Deneyimli bir kullanıcı tarafından günde 10'a kadar retina temizlenip monte edilebildiğinden, bu protokole başlamadan önce eşit sayıda kontrol ve deneysel retinayı işlemeyi planlayın.
- İn vivo, sitokinler kokteyli ile muamele edilmiş numuneler için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- Tüm retina damar sistemindeki apoptotik cisimlerin (TUNEL/DAPI çift pozitif türler) sayısını manuel olarak sayın.
- Rastgele seçilen bir çift DM dışı ve DM örneği arasındaki apoptotik cisimlerin sayısındaki kat değişimini hesaplayın.
- İki kuyruklu öğrenci t-testini kullanarak istatistiksel olarak anlamlı bir fark olup olmadığını belirleyin.
- Ex vivo, TBH ile muamele edilmiş numuneler için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
Representative Results
Retina damar sisteminin başarılı bir şekilde izole edilmesi, fare retina damar sisteminin tüm ağının mimari bütünlüğü bozulmadan düz bir şekilde monte edilmesiyle sonuçlanır (Şekil 2J). Periyodik asit-schiff hematoksilen (PASH) ile boyandıktan sonra, iki vasküler hücre tipini ayırt etmek mümkündür: endotel hücreleri (EC'ler) ve perisitler (PC'ler) (Şekil 6). Endotel hücre çekirdekleri uzar, hafifçe boyanır ve tamamen damar duvarlarında bulunur. Perisit çekirdekleri daireseldir, yoğun bir şekilde boyanır ve kılcal duvarlardan çıkıntı yapar. PASH ile boyanmış numuneler ayrıca çekirdekleri olmayan aselüler kılcal damarları da ortaya çıkarır.
Ölüme neden olma yaklaşımı, aşağıdaki mantıkla yönlendirildi. Korumanın sınırlı olduğu, yani ölüme neden olan çok güçlü bir hakaretle boğulabileceği tahmin ediliyordu. Sonuç olarak, hakaretler (hem iskemi / oksidatif stres hem de sitokinler18), kolayca tespit edilebilir bir artışa neden olacak şekilde optimize edildi, ancak yine de submaksimal ölüm derecesi (Şekil 3 ve Şekil 5).
TUNEL-pozitif çekirdeklerin varlığının, hücre ölümünü tetiklemek için kullanılan spesifik hakaret türüne bağlı olduğunu vurgulamak önemlidir. İskemi / oksidatif stres hakareti, Şekil 3'te gösterildiği gibi, hücre apoptozunun tramvay yolu paternine yol açarken, sitokin hakareti, Şekil 5'te gösterildiği gibi farklı ve iyi tanımlanmış bir paternle sonuçlandı. Her iki model de DR hastalarından22 retina damarlarında gözlemlenebilir, bu da her iki tip ajanın da insanlarda hücre ölümünü indüklediğini düşündürür. Ayrıca, gözlenen morfolojik ayrımlar, patolojinin oksidatif stres veya sitokinler tarafından yönlendirilip yönlendirilmediğini değerlendirmek için bir araç sunar.
Şekil 1: Fare retina damar sistemini izole etmek için araçlar. Soldan sağa: montaj kaseti, iki tek saç fırçası, ters çevrilmiş bir transfer pipeti, mikro spatula, iki kavisli forseps, yaylı makas, mikro bıçak ve düz uçlu forseps. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ölüme neden olan bir hakaret etmenin ve ardından retina damar sistemini bir fare gözünden izole etmenin temel adımlarını gösteren şematik. (A) İskemi / oksidatif hasarın indüksiyonu, ex vivo. Enükleasyondan sonra, göz küresi TBH varlığında iskemiye maruz kalır. (B) Sitokinlerin in vivo uygulaması (intravitreal enjeksiyon). (C) Göz küresini ikiye bölmek. (D) Retinal enzimik sindirim: skleranın çıkarılması ve retinanın gece boyunca çift damıtılmış suda yıkanması. YL tripsin çözeltisinde 37 ° C'de 4 saat 15 dakika boyunca 24 oyuklu bir plakanın kuyusunda inkübe edilir. (E) Fotoreseptörlerin çıkarılması. (F) Kalan nöral ve glial dokunun çıkarılması. (G) Temizlenmiş çanak şeklindeki damar ağı yukarı bakacak şekilde. (H) Diseksiyon mikroskobu sahnesinde siyah arka plana sahip 35 mm'lik bir çanakta izole vasküler ağ. (I) Bir slayt üzerine düz monte edilmiş retina damar sistemi. (J) Bir slayt üzerinde havayla kurutulmuş retina damar sistemi. Bu rakam Li ve ark.18'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İskemi +/- TBH ile ex vivo tedavi edilen fare retina damarlarındaki apoptotik cisimlerin saptanması. İzole retina damarlarında iskemi +/- öküz stresine bağlı apoptotik cisimlerin temsili görüntüleri. Her sütunun başlığı boyamayı gösterir. (A-C) Sadece 1 saat iskemi geçiren gözbebeklerinden izole edilen retina damarları. (D-F) (A-C) ile aynı, ancak 1 saatlik hakaret iskemi ve oksidatif stresin (5 mM TBH) bir kombinasyonuydu. Kırmızı oklar, temsili TUNEL/DAPI çift pozitif türlerine işaret ediyor. (G-I) DNaz ile tedavi edilen pozitif kontrol. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam Li ve ark.18'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sonuçların nicelleştirilmesi için alan seçiminin gösterimi. TUNEL ve DAPI sinyalinin birleştirilmesiyle retina damar sisteminin 5 x 5 karo taraması. Optik siniri çevreleyen uzak periferdeki altı ila sekiz alanın seçimi kırmızı karelerle gösterilir. Büyütme, 200x. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İntravitreal sitokin enjeksiyonuna (in vivo uygulama) yanıt olarak fare retina damarlarındaki apoptotik cisimlerin saptanması. İzole retina damarlarında sitokin kaynaklı apoptotik cisimlerin temsili görüntüleri. Her sütunun başlığı boyamayı gösterir. (A-C) PBS ile intravitreal enjekte edilen farelerden izole edilen retina damarlarının görüntüleri. (D-F) PBS ile birlikte bir sitokin kokteyli enjekte edilmesi dışında (AC) ile aynı. Kırmızı oklar, temsili TUNEL-pozitif türlere işaret ediyor. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakam Li ve ark.18'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: PASH ile boyanmış retina damarlarının temsili bir görüntüsü. 20 hafta boyunca STZ'nin neden olduğu DM yaşayan bir farenin retina damarları, Şekil 2'de tarif edildiği gibi izole edildi, PASH ile boyandı ve görünür ışıkla aydınlatılırken görüntülendi. Kılcal damarlardaki perisit çekirdekleri daha dairesel ve yoğun lekeli (mavi oklar) olma eğilimindeyken, uzun ve daha az yoğun boyanmış çekirdekler endotel hücrelerinin (kırmızı oklar) tanısıdır. Sarı ok, hücresel olmayan bir kılcal damarı gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu çalışmada, iskemi/oksidatif stres ve sitokinler gibi DM/DR ile ilişkili hakaretlerin neden olduğu retina damar sisteminin ölüme karşı direncini/savunmasızlığını tespit etmek için bir test oluşturulmuştur. Bu makale, yayınlanmış birkaç protokol 19,20,21'in bir modifikasyonu olan bu testin ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır.
Protokol birkaç önemli aşamayı kapsar. İlk olarak, retinayı titizlikle incelemek, damar ağının korunmasını sağlamak ve önemli yırtıkları önlemek zorunludur. Bu, retina ora serrata'ya sıkıca yapıştığı için limbusun 2-3 mm arkasında bir kesi yapılarak gerçekleştirilebilir ve onu ayırmak zordur. İkinci olarak, damarlarla temas eden tüm aletleri (örneğin, tek kıllı fırçalar, transfer pipeti ve forseps) bu aletleri prosedür boyunca YL tripsin çözeltisine batırarak tripsin ile kaplayın. Bu, damar sisteminin bu protokolde kullanılan aletlere yapışmasını önler. Üçüncüsü, mikrovasküler sistem normal ışık altında neredeyse görünmez olduğundan, kazara kaybı önlemek için enkaz aspirasyonu ve mikroskop lamına aktarım sırasında daha fazla dikkat gereklidir.
Retinanın çeşitli katmanlarının uygun bir enzimatik sindirim derecesi çok önemlidir; Yetersiz sindirim, nöronal dokunun damar ağından ayrılmasını engellerken, aşırı sindirim vasküler pleksusu çözer. 1 saat19 ile gece 23 arasında değişen çeşitli sindirim süreleri bildirilmiştir. Gözlemlere dayanarak, 4 saat ve 15 dakikalık bir sindirim süresi, 2 saat, 3 saat ve 4 saatlik sürelere kıyasla en olumlu sonuçları verir. Sindirimi bu noktanın ötesine uzatmak, süreci geliştirmesi olası değildir ve bunun yerine vaskülatürün bütünlüğünü tehlikeye atabilir.
Sindirilmiş retinanın tek saç fırçasına yapıştığı durumlarda, saçı birkaç kez YL tripsin çözeltisine batırın. Bu, fırçanın yapışkan alanlarını azaltır. Saç fırçası hala vasküler dokuya yapışırsa, vitreusun kalan parçalarını kontrol edin ve forseps ile çıkarın.
Vitreusun tamamen çıkarılması için en uygun an, fotoreseptörlerin ortadan kaldırılmasından sonra, ancak kalan nöral ve glial dokunun çıkarılmasından öncedir. Retina, fotoreseptörler çıkarılana kadar sertliğini korur. Bu aşamada vitreusun çıkarılması potansiyel olarak retinayı/damar sistemini yırtabilir. Rezidüel nöral ve glial dokunun hassas katmanları, vasküler yapının kavisli formunun korunmasında çok önemli bir rol oynar. Vitreus optik sinirden ayrıldığında retinanın merkezinde yırtılmasını önlerler.
İzole edilen damar sistemi mikroskop lamına hiç yapışmıyorsa, lamın adezyonun oluşması beklenen bölümünün kirli olduğunu gösterir. Yapışkan bir nokta bulmak için kapları slaytın yüzeyinde hareket ettirmeyi, farklı bir slayta geçmeyi veya slaytı titizlikle temizlemeyi ve tekrar denemeyi deneyin. Damarlar, kase benzeri şekillerine açılmadan önce slayta yapışırsa, suda bir kez daha serbestçe yüzmesini sağlamak için damar sistemini slayttan kaldırın. Bu adımı, YL tripsin çözeltisine tekrar tekrar batırılmış forseps ile yapın.
Damar sistemini izole etmek için, burada tarif edilen koruma testi için uygun olmayacak birkaç alternatif teknik bildirilmiştir. Örneğin, vaskülatürü sabitlenmemiş retina örneklerinden izole etmek için ozmotik lizis kullanılmıştır ve dokunun biyokimyasal araştırmalarını kolaylaştırmıştır24,25. Bununla birlikte, bu prosedür vaskülatürün anatomisini ve bu makalede kullanılan yaklaşımı koruyamayabilir. Benzer şekilde, mikrovaskülatürün büyük segmentlerini izole etmek için doku izi yöntemi, vaskülatürün elektrotonik mimarisinin26 analizini sağlarken, tüm vasküler yatak tipik olarak geri kazanılmaz.
Bu test, kılcal dejenerasyonu izlemek için mevcut yaklaşımların koruma konusunu ele almaması nedeniyle geliştirilmiştir. Uzun süreli DM'den sonra ortaya çıkan kılcal dejenerasyon, DR'nin gelişip gelişmediğini gösterir. DR tanısına ek olarak, bu sonuç bir ajanın/tedavinin DR'yi önleyip önlemediğini değerlendirmek için yararlıdır. Bununla birlikte, mevcut kılcal dejenerasyon testleri, ajanın altta yatan etki mekanizmasına değinmemektedir. Böyle bir ajan, artmış oksidatif stres veya sitokinler gibi DR'yi yönlendiren patolojik olayları önleyebilir. Alternatif olarak, ajan oksidatif strese ve sitokinlere karşı direnci artırarak korumayı sağlayabilir ve/veya hasarın onarımını teşvik edebilir. Bu yeni koruma testi, belirli bir tedavinin yararlı etkisinin, DM ile ilişkili ölümden koruyan endojen sistemin uygulanmasını içerip içermediğini belirlemek için kullanılabilir.
Bu koruma testinin bir dezavantajı, retina damarları içindeki iki hücre tipini ayırt etmemesidir: endotel hücreleri (EC'ler) ve perisitler (PC'ler). Çekirdeklerinin PASH ile boyanmış bölümlerdeki görünümü hücre tipine özgü olsa da (Şekil 6), her çekirdek tanısal özellikler göstermez. Çekirdeklerin yaklaşık% 30'u, en azından kısmen, açık bir şekilde EC veya PC olarak tanımlanamaz, çünkü PASH ile boyanmış örneklerden elde edilen iki boyutlu görüntüler, vasküler pleksusun üç boyutlu yapısını tam olarak çözemez. Bu engel, hücre tipine özgü belirteçlerle immünofloresan boyama gibi ek analizlerle aşılabilir. İki hücre tipini birbirinden ayıran bu tür görüntüler, vasküler hücre tiplerinin her birinin direncini / savunmasızlığını belirlemek için TUNEL ile birlikte boyanabilir.
Bu vasküler odaklı test, nöral retina ile ilgili herhangi bir bilgi sağlamaz. Bu tür bilgileri sağlamak için ek tahliller geliştirilebilir. Örneğin, retina damar sistemini izole etmek yerine, tüm retinanın tek bir hücre süspansiyonu üretilebilir ve daha sonra direnç / kırılganlık açısından (floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması ile) analiz edilebilir. Hücre tipine özgü belirteçlerin (hem nöral hem de vasküler) hücre ölümü göstergeleri ile birlikte dahil edilmesi, DM / DR aracılı ölümden korunma kapasitesine sahip retinal hücre tiplerinin daha eksiksiz bir resmini sağlayacaktır.
Sonuç olarak, burada açıklanan koruma testi, farelerde DM'nin başlangıcı ile DR'nin tezahürü arasındaki gecikmeden sorumlu mekanizmayı araştırmak için güçlü bir yaklaşım sağlar.
Disclosures
Yazarların bildirecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Illinois Körlüğü Önleme Derneği, Ulusal Sağlık Enstitüsü (EY031350 ve EY001792) ve Körlüğü Önleme Araştırmaları Vakfı'ndan sınırsız bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | Fixation |
| 24-well plates | Falcon | 353047 | |
| 33 G needle | Hamilton | customized | |
| Ammonium hydroxide | Sigma | 221228-1L-PCA | |
| C57/BL6/J mice | The Jackson Laboratory | Jax #000664 | |
| Cytokine cocktail | consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ | ||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. | ||
| Dumont #3 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11231-30 | Straight tips |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11253-25 | Micro-blunted tips |
| Easy-Grip Tissue Culture Dishes | Falcon | 353001 | 35 x 10 mm |
| Glass transfer pipet | Fischer Scientific | 1367820A | snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb. |
| Harris modified hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Image J | NIH, Bethesda | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Milipore | 11684795910 | TUNEL reaction mixture |
| Micro cover glasses | VWR | 48366-227 | 22 mm x 22 mm |
| Microknife | Sharpoint | 72-1551 | |
| Micro-spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Mounting cassette | Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide | ||
| Periodic acid | Sigma | 3951 | |
| Periodic acid solution | 35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate in H2O | ||
| Permount mounting medium | Fischer Scientific | SP15- 100 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Prolog Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Recombinant human IFN- γ | Peprotec | 300-02 | |
| Recombinant human IL-1 β | Peprotec | 200-01B | |
| Recombinant human TNF-α | Peprotec | 300-01A | |
| Schiff reagent base | Sigma | 3952016 | |
| Shaker Incubator (belly button shaker) | IBI Scientific | BBUAAUV1S | |
| Sodium acetate | Sigma | 71196 | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| Superfrost Plus treated microscope slides | Fischer Scientific | 12-550-15 | use slides from unopened box |
| Tert-butyl hydroperoxide (TBH) | Sigma | 75-91-2 | |
| TRIZMA base | Fischer Scientific | 11-101-5522 | make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl) |
| Trypsin 1:250 | Amresco | 0458-50G | |
| Two “brushes” | made from single black hair taped to the end of plastic transfer pipet. One brush with a free end. The other brush with a loop | ||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-00 | |
| Xylene | Sigma | 65351-M | |
| YL trypsin solution | 3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8) | ||
| Zeiss LSM 710 fluorescence microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Teo, Z. L., et al. Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).
- Lee, R., Wong, T. Y., Sabanayagam, C. Epidemiology of diabetic retinopathy, diabetic macular edema and related vision loss. Eye Vis (Lond). 2, 21 (2015).
- Lima, V. C., Cavalieri, G. C., Lima, M. C., Nazario, N. O., Lima, G. C. Risk factors for diabetic retinopathy: A case-control study. Int J Retina Vitreous. 2, 21 (2016).
- Sabanayagam, C., Yip, W., Ting, D. S., Tan, G., Wong, T. Y. Ten emerging trends in the epidemiology of diabetic retinopathy. Ophthalmic Epidemiol. 23 (4), 209-222 (2016).
- Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
- Wong, T., Cheung, C., Larsen, M., Sharma, S., Simó, R.
- Wu, M. Y., Yiang, G. T., Lai, T. T., Li, C. J. The oxidative stress and mitochondrial dysfunction during the pathogenesis of diabetic retinopathy. Oxid Med Cell Longev. 2018, 3420187 (2018).
- Hietala, K., Harjutsalo, V., Forsblom, C., Summanen, P., Groop, P. H. Age at onset and the risk of proliferative retinopathy in type 1 diabetes. Diabetes Care. 33 (6), 1315-1319 (2010).
- Aiello, L. P., et al.
- Klein, R., Klein, B. E., Moss, S. E., Davis, M. D., Demets, D. L. The wisconsin epidemiologic study of diabetic retinopathy. Prevalence and risk of diabetic retinopathy when age at diagnosis is less than 30 years. Arch Ophthalmol. 102 (4), 520-526 (1984).
- Nathan, D. M., et al. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med. 329 (14), 977-986 (1993).
- Clustering of long-term complications in families with diabetes in the diabetes control and complications trial. The diabetes control and complications trial research group. Diabetes. 46 (11), 1829-1839 (1997).
- Cruickshanks, K. J., Moss, S. E., Klein, R., Klein, B. E. Physical activity and proliferative retinopathy in people diagnosed with diabetes before age 30 yr. Diabetes Care. 15 (10), 1267-1272 (1992).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: From molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5 (4), 444-456 (2012).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. J Neurophysiol. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Sergeys, J., et al. Longitudinal in vivo characterization of the streptozotocin-induced diabetic mouse model: Focus on early inner retinal responses. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (2), 807-822 (2019).
- Sun, J. K., et al. Protection from retinopathy and other complications in patients with type 1 diabetes of extreme duration: The joslin 50-year medalist study. Diabetes Care. 34 (4), 968-974 (2011).
- Li, Y., et al. The slow progression of diabetic retinopathy is associated with transient protection of retinal vessels from death. Int J Mol Sci. 24 (13), 10869 (2023).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. J Vis Exp. 76, e50489 (2013).
- Veenstra, A., et al. Diabetic retinopathy: Retina-specific methods for maintenance of diabetic rodents and evaluation of vascular histopathology and molecular abnormalities. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 247-270 (2015).
- Zheng, L., Gong, B., Hatala, D. A., Kern, T. S. Retinal ischemia and reperfusion causes capillary degeneration: Similarities to diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 361-367 (2007).
- Mizutani, M., Kern, T. S., Lorenzi, M. Accelerated death of retinal microvascular cells in human and experimental diabetic retinopathy. J Clin Invest. 97 (12), 2883-2890 (1996).
- Weerasekera, L. Y., Balmer, L. A., Ram, R., Morahan, G. Characterization of retinal vascular and neural damage in a novel model of diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3721-3730 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53 (9), 2404-2411 (2004).
- Podestà, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am J Pathol. 156 (3), 1025-1032 (2000).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights. Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).
