Drosophila Y-maze Assay: Eine Methode zur Bewertung olfaktorischer Reaktionen bei Fliegen

Overview

Dieses Video beschreibt eine Methode, um olfaktorisches Explorativverhalten in der Fruchtfliege zu testen, das als Y-Maze bezeichnet wird. Der vorgestellte Protokollclip zeigt, wie der Assay eingerichtet und durchgeführt wird.

Protocol

Dieser Protokolltext ist ein Auszug aus Simonnet et al.,Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay, J. Vis. Exp. (2014).

1. Vor dem Start

1. Verwenden Sie einen isogenisierten Referenzbestand mit stabilen und robusten Verhaltensphänotypen. Es gibt keine allgemeine Regel für die Wahl dieses Bestands, da alle potenziellen Kontrollen heterogene Hintergrundallele tragen können.
2. Verwenden Sie diese Kontrollspannung, um alle anderen Bestände, die für spätere Schritte erforderlich sind, zu überqueren. Dieser Rückschritt wird in der Regel durch mindestens 5 aufeinander folgende Kreuze eines einzelnen jungfrauen Weibchens (um eine mögliche Überquerung zwischen homologen Chromosomen zu ermöglichen) zu 2–3 isogenen Referenzmännchen dargestellt. Dieser Schritt ist wichtig, um den genetischen Hintergrund zwischen den verschiedenen Flugbeständen zu homogenisieren.
3. Erhalten Sie Drosophila-Bestände auf einem Standard-Maismehl (9%), Hefe (10%) und Agarmedium (1,5%) mit Antibiotikum (0,4% Methylparahydroxy-Benzoat) in einem 12-stunden-Licht-/Dunkelzyklus bei 25 °C ergänzt.
4. Erreichen Sie chemosensorische Experimente in einem temperaturgeregelten Raum (25 °C) unter weitrotem Licht (um den Beitrag visueller Hinweise zu eliminieren und sich auf chemosensorische Signale zu konzentrieren). Erneuern Sie regelmäßig die Raumluft, um den Bereich zwischen den einzelnen Experimenten zu belüften.

2. Olfaktorische Reaktion mit einem Y-Maze Assay

1. Verhungern Sie die Fliegen für 16–18 Stunden bei 25 °C in Glasröhren mit nassem Papiertuch vor dem Testen.
2. Verbinden Sie einen Y-förmigen Steckverbinder mit zwei Glasfläschchen und einer kleineren Kunststoff-Durchstechflasche (Ladefläschchen). Verwenden Sie 1 ml Pipettenspitzen, die durch die Schaumstopfen passieren, um den Stecker mit den drei Durchstechflaschen zu verbinden und ein dicht verschlossenes Y-Labyrinth zu erhalten. Schneiden Sie die schmalen Enden von zwei Pipettenspitzen (2 mm Durchmesser, um jede Rückkehr der Fliege zu vermeiden, sobald sie ihre Entscheidung getroffen hat), um zwei "Falle" Fläschchen zu bilden, und ein großes Ende einer Pipettenspitze, um das "Laderohr" zu bilden (Abbildung 1A).
3. Kurz vor dem Anschluss der "Trap"-Fläschchen (Abbildung 1B) legen Sie ein Filterpapier mit einem Durchmesser von 6 mm in jede Durchstechflasche. Fügen Sie 40 l Geruchslösung auf ein Filterpapier und 40 l des entsprechenden Lösungsmittels auf das zweite Filterpapier.
4. Stellen Sie zehn 4 bis 9 Tage alte Fliegen in die "Lade" Durchstechflasche vor. Verwenden Sie während dieser Übertragung keine CO2-Anästhesie, da sie einen starken Einfluss auf das Verhalten hat. Verwenden Sie lieber kurze Kühlung auf Eis. Richtige Manipulation von anästhesierten Fliegen ist wichtig, um die Belastung der Probanden so weit wie möglich zu begrenzen.
   1. Führen Sie eine Reihe von Y-Maze-Tests bei 25 °C unter rot-rotem Licht durch (mit LED-Lampen zur Begrenzung möglicher Heizquellen), um visuelle Reize so weit wie möglich zu vermeiden. Achten Sie darauf, die Ausrichtungen der Y-Mazes (Geruchsstoff, das Rohr auf der linken oder rechten Seite enthält, und Laderohr vor oder hinten zu wechseln; Abbildung 1C).
   2. Lassen Sie mehrere Stunden für die Fliegen in die Falle Durchstechflasche mit dem Geruchsstoff oder das Lösungsmittel zu betreten. Count fliegt nach 24 Stunden, um die Beteiligung auf über 80% zu erhöhen und den maximalen olfaktorischen Indexwert (Simonnet, persönliche Kommunikation) bereitzustellen.
   3. Berechnen Sie den resultierenden Geruchsindex mit der folgenden Formel: (Zahl im Geruchsrohr - Zahl im Lösungsmittelrohr)/Gesamtanzahl der geladenen Fliegen.
5. Y-Maze-Setup wie folgt waschen: Das demontierte Set-up in RBS 35 MD über Nacht einweichen. Gründlich mit Leitungswasser ausspülen. Zum Schluss mit entionisiertem Wasser abspülen und austrocknen lassen.

3. Statistische Analyse der Daten

1. Führen Sie je nach Daten und Variablen einen t-Test, eine einwegige ANOVA oder eine zweiseitige ANOVA durch.

Representative Results

Abbildung 1: Männliche geruchsbefruchtende Reaktion, die mit einem Y-Maze-Setup bewertet wird. A) Split-Gerät. B) Montiertes Gerät. C) Aufbau im Betriebszustand unter rot-rotem Licht. D) Quantifizierung männlicher olfaktorischer Reaktionen auf Essigsäure (AA) oder Phenylessigsäure (PAA), die beide in destilliertem Wasser (10% v/v) verdünnt werden (N = 11, was insgesamt 110 Fliegen entspricht). Die statistische Analyse wurde mit einem t-Test durchgeführt, der die Daten mit 0 vergleicht. 0 bedeutet keine Präferenz. Ein negativer Wert gibt eine Abneigung gegen das Gerüche an, und ein positiver Wert eine Attraktion. : p < 0,0001; ns: nicht signifikant (p = 0,1680). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Polystyrene tube	VWR europe	734-2255	30 x 25 mm Y-maze
Drosophila Borosilicate tube	Dijon verre		95 X 25 mm Y-maze
Foam stopper	Dutscher	999038	Y-maze
Y-shaped connector	Europrix	11020605	Y-maze
100-1,000 µl pipette tips	Corning	4868	Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ~2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial.
Far-Red LED Bulb	Rubin-Lacaque	0RB180238	625-630 nm
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	45725
Phenylacetic Acid	Sigma-Aldrich	P16621
Yeast	Sensient Flavors Strasbourg	1018880464
Cornmeal	eurogerm	Farine de maïs
Agar	Kalys	HP-697-25
Methyl hydroxy 4 benzoate	VWR international	25605293