Drosophila Optogenetik: Nöronal Devreleri Manipüle Etme Yöntemi

Overview

Optogenetik, ışık aktivasyonu nöronun durumunda bir değişikliği tetikleyen belirli opsinleri ifade etmek için genetik olarak tasarlanmış nöronları manipüle etmek için ışık kullanımını sağlar. Burada Opsin Channelrhodopsin2 kullanarak Drosophila optogenetik bir yaklaşım tarif ediyoruz. Örnek protokol, sineğin kaçış davranışının arkasındaki nöronal devreyi incelemek için ayarlanmış bir optogenetik test içerir.

Protocol

Bu protokol, Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2013)'de Kaçış Davranışının Optogenetik Uyarılması de Vries ve Clandinin'den bir alıntıdır.

1. Channelrhodopsin Sinekleri Üret

1. Cross UAS-ChR2 seçtiğiniz Gal4 sürücüsü ile uçar, optik lobdaki Foma-1 nöronlarında ifade edilen G105-Gal4 kullanıyoruz.
2. Mavi ışık stimülasyonuna görsel bir yanıt olasılığını ortadan kaldırmak için, her iki uçucu çizgi de w⁺norpA arka plandadır.
3. Sonuç: w⁺norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. Yetişkin sinekler eclose sonra, davranışsal tahlil gerçekleştirmeden önce 3 gün boyunca 10 μM all-trans-retinal (ChR2 için gerekli bir ortak faktör) ile desteklenmiş ve ışıktan korunan taze yiyeceklere seçilmiş dişileri koyun.

2. 10 μM All-trans-retinal Geliştirilmiş Gıda olun

1. 20 mM retina yapmak için 17.6 ml%95 etanolde 100 mg all-trans-retinal çözün. Tüm trans-retinaları her zaman ışıktan koruyun.
2. Standart mısır unu sineği yiyeceklerini mikrodalga fırında eritin ve dokunmak için ısınana kadar soğumaya bırakın.
3. 50 μl 20 mM all-trans-retinal'ı 10 ml sinek maması şişelerine karıştırın.
4. Şişeleri soğumaya bırakın ve ışıktan koruyun.

3. Ekipman

1. Pipet uçları: Standart 1.000 μl pipet uçları ucun yakınında kesilir ve ~2,25 mm gözenek çapı oluşturulur.
2. Platform (bkz. Şekil 1).
   1. 17 cm X 25 cm'lik delrin tabanı, 1/4" NPT soğutma sıvısı hortum konnektörlerine uyacak şekilde her köşede dişli deliklerle inşa edilmiştir.
   2. Delrin'den yapılmış dikey bir tutucu tabanın ortasına tutturulur. Genel boyutlar 25 mm X 40 mm X 65 mm 'dir (genişlik X derinlik X yüksekliği). 10 mm genişliğinde bir oluk, altta bir başparmak vidası ile tutucunun uzunluğunu çalıştırır. Tutucunun üstüne 25 mm X 40 mm X 10 mm'lik bir platform takılıdır ve tutucudaki olukla hizalanmış 3,5 mm çapında bir delik vardır.
3. LED dizileri (bkz. Şekil 1).
   1. Dört kol soğutma sıvısı hortumu, ~18 cm uzunluğunda, soğutma sıvısı hortum konektörü kullanılarak platform tabanına yapıştırılmıştır. Soğutma sıvısı hortumu sadece yapısal destek olarak kullanılır ve soğutma amacıyla kullanılmaz.
   2. Düzgün aralıklı oluklar, her kolun ucuna bir ısı emici yapıştırmak için her kolun son soğutucu çapalama parçasına kesilir.
   3. Mavi bir LED Asi Tri-Star, önceden kesilmiş termal yapışkan bant kullanılarak her ısı emiciye monte edilir. Her Tri-Star'a bir Carclo 18° Tri-lens yapıştırıldı.
   4. LED Tri-Star'lar BuckPuck DC sürücülerine ve belirtilen güç kaynağına bağlanır. Her BuckPuck ile seri olarak iki Tri-Star'a güç veren bir kurulum ayarladık.
   5. 700 mA'daki dört LED Tri-Star'ın da aydınlatılması, platformumuzda 713 W/m^2'lik bir ışınlanma sağladı.
4. Kamera: Kamera küçük bir tripod üzerine monte edilmiş ve platformun üstüne odaklanmıştır.

4. Davranışsal Tahlil

1. Buzdaki sinekleri kısaca uyuşturun.
2. Ucun her iki ucunu kapatmak için bant kullanarak pipet uçlarına tek tek sinekler yerleştirin.
3. Sinekler uyandıktan ve pipet ucunu aktif olarak keşfettikten sonra, bandı çıkarın ve dikey tutucudaki oluğa bir pipet yerleştirin. Başparmak vidası, pipet ucunu yerinde sabitlemek ve ucun altını kapatmak için kullanılır.
4. Sinek pipet ucunu (genellikle 30 - 60 sn) keşfederken, uç uçtan platforma çıkmadan hemen önce kamera kaydını başlatın.
5. Sinek platforma çıktıktan sonra, 1-2 saniye bekleyin ve mavi LED'leri açın. Sinek uçuşa başlayana kadar geçen süreyi manuel olarak ölçmek için bir zamanlayıcı kullanın.

Representative Results

Şekil 1: Platformu dikey tutucu ve ısı emicileri tutan dört soğutma sıvısı çapalama kolu ile gösteren deneysel kurulum ve bunlara LED dizileri yapıştırılmış. (A) Ortam aydınlatması altında kurulum. (B) LED'ler aydınlatıldığında kurulum. (C) Isı emici üzerinde bir Tri-Star LED'in yakından görünümü. (D) Tri-Star'ın tri-lens takılı bir yakın çekimi. (E) Buckpuck Sürücüsü ve LED devresinin şeması. (F) BuckPuck ve LED devresi için devre şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
All-trans Retinal	Advance Scientific Chemical Inc	R3041
Equipment
Heat Sink 9.2 C/W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm square X 30 mm high
Carclo 18° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Blue Rebel LED on Tri-Star Base	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC Driver	Luxeonstar	3021-D-E-700
Wiring Harness for BuckPuck Driver	Luxeonstar	3021-HE
Pre-cut thermal adhesive tape	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm Hex Base
Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc Coolant Hose Connector	McMaster-Carr	5307K39	¼" NPT Male
Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply	BK Precision	1698
Exilim camera	Casio	EX-FH20