Overview
Denna video introducerar en kortsiktig överlevnadsanalys som testar en behandling för akut toxicitet eller testar en genetisk stam för resistens mot ett giftigt tillstånd. Exempelprotokollet visar ett exempel på överlevnadsanalys där maskar testas för sin förmåga att motstå oxidativ stress inducerad av parakvat (PQ).
Protocol
Detta protokoll är ett utdrag från Possik och Pause, Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans i 96-well Microtiter Plates, J. Vis. Exp. (2015).
1. Utföra oxidativ stressresistensanalys
- Pipett 40 μl av 100 mM PQ-lösningen (beredd färsk) till varje brunn på en 96 brunnsplatta. Använd minst 12 brunnar som replikat av varje tillstånd (behandling, mutant, etc.). Använd en platinatrådmaskplockning, överför 5-8 L4 larver djur till varje brunn som indikerar starttiden och sluttiden.
- När du startar ett annat villkor bör du notera starttiden och sluttiden. Placera plattan vid 20 °C i inkubationstiden mellan överföring av maskarna och poängsättning av döda djur en timme senare från starttiden.
- Använd det dissekerande mikroskopet, räkna överlevnad varje timme. Skaka försiktigt plattan innan du börjar räkna. Ange maskar som inte rör sig, även efter att ha upptäckat ett högintensivt ljus, som döda djur. Ange också antalet djur som lever.
OBS: Att titta på maskform, svansar och huvudrörelser vid hög förstoring hjälper till att bestämma döda maskar från levande. - Upprepa det här steget varje timme tills de flesta maskar är döda.
2. Fastställande av överlevnadsprocent vid varje tidpunkt
- Beräkna det totala antalet djur per tillstånd genom att lägga till det totala antalet djur som överförs till varje brunn. Ignorera de djur som skadas eller avlivas vid överföringen.
- För varje tidpunkt, beräkna det totala antalet döda djur per tillstånd (summan av döda djur i de 12 brunnarna). För varje tidpunkt, beräkna procentandelen död (antalet döda djur dividerat med totalt antal djur och multiplicerat med 100) och procentandel av överlevnaden (100 minus procent död).
- Upprepa denna analys minst 3 oberoende gånger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Discovery v8 stereo zeiss microscope | Zeiss | ||
| 96 well clear microtiter plate |
