C. elegans Chemotaxis Assay: een methode om chemosensatie in wormen te testen

Overview

Deze video introduceert chemotaxis in het nematode C. elegans en toont een monsterprotocol dat chemotactische afkeer van kopersulfaat test.

Protocol

Het volgende protocol is een fragment uit Campbell et al, A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Bereiding van experimentele organismen
   1. Kies 24 uur voor aanvang van de test 10 L4-geënsceneerde nematoden per stam om er zeker van te zijn dat organismen jongvolwassen zijn wanneer ze worden getest. Kies voor elke geteste mutant of controleaaltje 10 L4's (10 voor de controle en 10 voor de test).
      1. Onderhoud L4-organismen met standaardmethoden gedurende 24 uur op standaard agarplaten gezaaid met OP50 Escherichia coli. Als organismen verloren gaan tijdens de daaropvolgende wasstappen, compenseer dit dan door de grootte van het startmonster te vergroten(d.w.z. pluk 20 wormen in plaats van 10).
         OPMERKING: Gedrag is een aangeboren variabel fenotype. Voer de methode in drievoud uit voor elke soort op drie afzonderlijke dagen. Voeg aanvullende controlestammen en voorwaarden voor nieuwe stammen toe, zoals benadrukt in het discussiegedeelte.
   2. Breng onmiddellijk voorafgaand aan de test experimentele organismen over op een agarplaat zonder bacteriën en laat nematoden 1 minuut vrij bewegen om overtollige bacteriën te verwijderen.
      1. Als experimentele organismen tijdens de 24 uur voorafgaand aan de test besmettingsomstandigheden hebben ondervonden, gooi ze dan weg.
   3. Pipetteer 1 ml M9 op de bacterievrije plaat om wormen in een microcentrifugebuis te wassen.
   4. Centrifugeer op 3.000 x g gedurende 1 min. Wormen moeten een pellet vormen aan de onderkant van de buis. Aspireer M9-oplossing zonder de wormkorrel te verstoren. Voeg 1 ml M9 toe aan de wormkorrel, keer de buis om om wormen met de oplossing te mengen.
   5. Herhaal stap 1.4 nog drie keer.
      1. Als overtollige bacteriën in eerste instantie met de wormen werden overgedragen, herhaal dit dan in totaal 5 keer. Er mogen geen bacteriën worden overgebracht naar de koperen voedselraceplaten. Als voedsel naar de testplaat wordt overgebracht, zal dit de nauwkeurige gegevensverzameling verstoren.
   6. Na de laatste wasbeurt aspireert u supernatant tot 100 μL M9 en blijft de wormkorrel over.
      Let op: Verhongeringsgerelateerd gedrag wordt na 30 minuten duidelijk. Bijgevolg moeten wormen onmiddellijk uit de oplossing worden overgebracht zodra de wasstappen zijn voltooid.
2. Voorbereiding van testplaten
   1. Bereid standaard NGM agar platen twee dagen voor de test.
      1. Als platen in een vochtige omgeving worden bewaard, maak dan 3 dagen voor de test agarplaten. U kunt ook het deksel van de plaat gedurende 3 - 6 uur verwijderen om een goede droogheid te garanderen (als u zich in een steriele omgeving bevindt).
   2. Maak met een dikke permanente markering een lijn aan de onderkant van de plaat langs de buitenrand en een andere om een mid-line barrière te vormen (figuur 1). De mid-line barrière moet op gelijke afstand van elke rand van de plaat staan. Gebruik een liniaal om nauwkeurige metingen te garanderen. Deze lijnen dienen als leidraad bij het overbrengen van bacteriën en de koperoplossing. Op voorwaarde dat E. coli wordt overgedragen vóór de koperoplossing, zullen deze lijnen als indicatoren dienen.
   3. Zaadplaat met 50 μL OP50 E. coli aan slechts één zijde van de koperbarrière om een uniform gazon te creëren (figuur 2). De bacteriële concentratie moet consistent blijven in alle testtesten; er is echter weinig variabiliteit waargenomen als reactie op milde concentratieverschillen.
      1. Gebruik de gemarkeerde lijnen aan de onderkant van de plaat om ervoor te zorgen dat de bacteriën niet in contact komen met de koperoplossing. Op voorwaarde dat de koperoplossing de rand van de plaat belijnt en een middenlijnbarrière vormt, breng de bacteriën over zodat de koperoplossing niet in contact komt met de voedselbron.
   4. Markeer een tweede set platen en breng er geen OP50 E. coli op over (figuur 2). Deze platen zullen dienen om de negatieve controle te evalueren. Deze platen moeten ook een markering op de ene helft van de plaat hebben om de oorspronkelijke oorsprong van de overdracht aan te geven.
   5. Laat bacteriën drogen en incubeer platen 's nachts bij 37 °C. Zorg ervoor dat bacteriële pleisters niet worden verstoord bij het overbrengen naar een incubator of kamer van 37 °C. Overmatige verstoring kan de locatie of vorm van de voedselpleister veranderen.
3. Chemotaxis Test
   1. Bereid een sulfaatoplossing van 0,5 M koper (II) vers voor de starttijd van de test. Op voorwaarde dat 125 μL van de oplossing per plaat wordt gebruikt, schaalt u dit volume op afhankelijk van het aantal gebruikte testplaten(bv. 5 testplaten, 625 μL).
   2. Pipet 100 μL van de koper (II) sulfaatoplossing aan de rand van de agar om een buitenste koperbarrière te creëren. De gemarkeerde onderkant van de plaat moet als leidraad dienen.
   3. Pipet 25 μL van de koper (II) sulfaatoplossing om een middellijnbarrière te creëren.
      1. Zorg ervoor dat de koperen (II) sulfaatoplossing niet in contact komt met de bacteriële pleister. Gebruik een gevlekte techniek, omdat strepen de voortbeweging kunnen beïnvloeden als gevolg van inkepingen/krassen op de agar.
   4. Laat de koperoplossing op de plaat drogen. De periode kan variëren afhankelijk van de plaat- en laboratoriumomstandigheden. Controleer elke 5 minuten na overdracht visueel op droogheid.
      OPMERKING: De koperen oplossing vertoont een blauwachtige tint en is gemakkelijk te herkennen. Gebruik een laboratoriumweefsel om de oplossing lichtjes in de buurt van de rand van de plaat te deppen om droogheid te onderscheiden.
   5. Pipet 20 μL van de wormkorrel van de bodem van de buis op de bacterievrije helft van de testplaat.
      1. Zorg ervoor dat er 10 wormen naar de testplaat worden overgebracht. Als er per ongeluk extra wormen zijn opgenomen, verwijder ze dan door ze te plukken met halokoolstofolie om ervoor te zorgen dat er geen bacteriën aan de plaat worden toegevoegd. Elke test moet een consistent aantal nematoden hebben tijdens de test.
         OPMERKING: Als er te weinig wormen worden overgedragen tijdens test, zal het verhogen van de initiële steekproefgrootte potentiële verliezen tijdens wasbeurten en overdrachten beperken.
   6. Verwijder overtollige M9 van de plaat met een laboratoriumweefsel. M9 mag niet in contact komen met de koperen (II) sulfaatoplossing.
      Let op: Zorg ervoor dat wormen en het agaroppervlak onaangetast blijven tijdens het uitvoeren van deze stap. Bij te hard gebruik kan het laboratoriumweefsel inkepingen op het agaroppervlak van de plaat veroorzaken en wormen verwijderen. Wormen die per ongeluk via KimWipe worden verwijderd, moeten worden weggegooid.
   7. Zodra de M9-oplossing is verwijderd en alle wormen niet-vloeibare locomotory-patronen zijn begonnen, start u de teststopwatch.
      1. Verwijder de M9-oplossing optimaal binnen een minuut. De essentiële parameter is de identificatie van sinusvormige voortbeweging. Wormen locomote anders, b.v. thrashing eerder dan sinusoidal, wanneer in vloeistof. Start het teststophorloge zodra elk van de experimentele organismen stopt met slaan.
   8. Controleer de testplaten elke 30 minuten.
      1. Voor de testplaten met bacteriële pleisters, positief scoren organismen als ze de voedselpleister bereiken over een periode van 4 uur. Voor de negatieve controleplaten, positief scoren organismen als ze de barrière zijn overschreden.

Representative Results

Figuur 1: Een visuele weergave van markeringen om de plaatsing van koperoplossing aan de onderkant van een petrischaal van 5 cm aan te geven. Deze indicaties worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de delen van de plaat op de juiste manier zijn gemeten en dienen als richtlijn bij het overbrengen van de bacteriële pleister en vervolgens koperoplossing op het agaroppervlak.

Figuur 2: De Petrischaal van 5 cm is verdeeld in twee secties voor aan- en uitvoertestplaten en een bacterieel gazon wordt gevormd in het midden van een van deze secties voor de on-food plaat. De voedselpleister mag niet in contact komen met de testverbinding die de randen van de plaat belijnt en een middellijnbarrière vormt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M