C. elegans Test de chimiotaxis: Une méthode pour tester la chimiosensation chez les vers

Overview

Cette vidéo introduit la chimiotaxis dans le nématode C. elegans et montre un protocole d’échantillon testant l’aversion chimiootactic au sulfate de cuivre.

Protocol

Le protocole suivant est un extrait de Campbell et coll., A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Préparation d’organismes expérimentaux
   1. Choisissez 10 nématodes mis en scène L4 par souche 24 h avant de commencer l’analyse pour s’assurer que les organismes sont de jeunes adultes lorsqu’ils sont testés. Pour chaque nématode mutant ou de contrôle testé, choisissez 10 L4 (10 pour le contrôle et 10 pour l’analyse).
      1. Maintenir les organismes L4 en utilisant des méthodes standard s'24 h sur les plaques d’agar standard ensemencées avec OP50 Escherichia coli. Si les organismes sont perdus au cours des étapes de lavage subséquentes, compensez en augmentant la taille de l’échantillon de départ(c.-à-d. cueillir 20 vers au lieu de 10).
         REMARQUE: Le comportement est un phénotype inné variable. Effectuez la méthode en triplicate pour chaque souche sur trois jours distincts. Inclure des souches et des conditions de contrôle supplémentaires pour les nouvelles souches, comme le souligne la section discussion.
   2. Immédiatement avant l’essai, transférer les organismes expérimentaux dans une plaque d’agar sans bactéries et permettre aux nématodes de se déplacer librement pendant 1 min pour éliminer l’excès de bactéries.
      1. Si les organismes expérimentaux ont connu des conditions de contamination pendant les 24 heures précédant l’analyse, jetez-les.
   3. Pipette 1 mL de M9 sur la plaque sans bactéries pour laver les vers dans un tube de microcentrifugeuse.
   4. Centrifugeuse à 3000 x g pendant 1 min. Les vers doivent former une pastille au fond du tube. Aspirer la solution M9 sans perturber la pastille de ver. Ajouter 1 mL de M9 à la pastille de ver, tube inversé pour mélanger les vers avec la solution.
   5. Répétez les étapes 1.4 trois fois de plus.
      1. Si l’excès de bactéries a d’abord été transféré avec les vers, répétez pour un total de 5 fois. Aucune bactérie ne doit être transférée dans les plaques de course de cuivre. Si les aliments sont transférés dans l’assiette d’analyse, cela interférera avec la collecte précise des données.
   6. Après le lavage final, aspirer le surnatant jusqu’à ce qu’il reste 100 μL de M9 et que la pastille de ver reste.
      Attention: Les comportements liés à la famine deviennent évidents après 30 min. Par conséquent, les vers doivent être immédiatement transférés de la solution une fois les étapes de lavage terminées.
2. Préparation des plaques d’essai
   1. Préparer les plaques d’agar NGM standard deux jours avant l’essai.
      1. Si les assiettes sont conservées dans un environnement humide, faire des plaques d’agar 3 jours avant l’essai. Alternativement, retirez le couvercle de la plaque pendant 3 - 6 h pour assurer une sécheresse appropriée (si dans un environnement stérile).
   2. À l’intérieur d’un marqueur permanent épais, faire une ligne sur le dessous de la plaque le long du bord extérieur et une autre pour former une barrière intermédiaire (figure 1). La barrière intermédiaire doit être équidistante de chaque bord de la plaque. Utilisez une règle pour assurer des mesures précises. Ces lignes serviront de guide lors du transfert des bactéries et de la solution de cuivre. À condition que E. coli soit transféré avant la solution de cuivre, ces lignes serviront d’indicateurs.
   3. Plaque de graines avec 50 μL d’OP50 E. coli sur un seul côté de la barrière de cuivre pour créer une pelouse uniforme (figure 2). La concentration bactérienne doit rester constante à travers les analyses; cependant, peu de variabilité a été observée en réponse à de légères différences de concentration.
      1. Utilisez les lignes marquées sur le dessous de la plaque pour vous assurer que les bactéries n’entrent pas en contact avec la solution de cuivre. À condition que la solution en cuivre tapisse le bord de la plaque et forme une barrière intermédiaire, transférez les bactéries de sorte que la solution de cuivre n’entre pas en contact avec la source alimentaire.
   4. Marquez un deuxième ensemble de plaques et ne leur transférez aucun OP50 E. coli (Figure 2). Ces plaques serviront à évaluer le contrôle négatif. Ces plaques doivent également avoir une marque sur la moitié de la plaque pour indiquer l’origine initiale du transfert.
   5. Laisser sécher les bactéries puis les incuber à 37 °C pendant la nuit. Assurez-vous que les plaques bactériennes ne sont pas perturbées lors du transfert vers un incubateur ou une pièce de 37 °C. Des perturbations excessives pourraient modifier l’emplacement ou la forme du patch alimentaire.
3. Test de chimiotaxis
   1. Préparez fraîchement une solution de sulfate de cuivre (II) de 0,5 M avant l’heure de début de l’essai. À condition que 125 μL de la solution soit utilisé par plaque, d’intensifier ce volume en fonction du nombre de plaques d’essai utilisées(p. ex. 5 plaques d’analyse, 625 μL).
   2. Pipette 100 μL de la solution de sulfate de cuivre (II) sur le bord de l’agar pour créer une barrière extérieure de cuivre. Le dessous marqué de la plaque doit servir de guide.
   3. Pipette 25 μL de la solution de sulfate de cuivre (II) pour créer une barrière médiane.
      1. Assurez-vous que la solution de sulfate de cuivre (II) n’entre pas en contact avec le patch bactérien. Utilisez une technique tachetée car les stries peuvent affecter la locomotion en raison d’indentations/rayures sur l’agar.
   4. Laissez sécher la solution en cuivre sur la plaque. La période peut varier en fonction des conditions de plaque et de laboratoire. Vérifiez visuellement la sécheresse toutes les 5 minutes après le transfert.
      REMARQUE: La solution en cuivre affiche une teinte bleuâtre et est facilement identifiable. Utilisez un tissu de laboratoire pour tamponner légèrement la solution près du bord de la plaque pour discerner la sécheresse.
   5. Pipette 20 μL de la pastille de ver du fond du tube sur la moitié sans bactéries de la plaque d’essai.
      1. Assurez-vous que 10 vers sont transférés dans la plaque d’analyse. Si des vers supplémentaires ont été accidentellement inclus, retirez-les en les cueillant avec de l’huile d’halocarbone pour vous assurer qu’aucune bactérie n’est ajoutée à la plaque. Chaque essai doit avoir un nombre constant de nématodes pendant l’analyse.
         REMARQUE: Si trop peu de vers sont transférés pendant les analyses, l’augmentation de la taille initiale de l’échantillon atténuera les pertes potentielles pendant les lavages et les transferts.
   6. Retirer l’excès de M9 de la plaque à l’aide d’un tissu de laboratoire. M9 ne doit pas entrer en contact avec la solution de sulfate de cuivre (II).
      Attention : Assurez-vous que les vers et la surface de l’agar ne sont pas affectés pendant l’exécution de cette étape. S’il est utilisé trop sévèrement, le tissu de laboratoire peut créer des indentations à la surface de l’agar de la plaque et peut éliminer les vers. Les vers accidentellement enlevés via KimWipe doivent être jetés.
   7. Une fois que la solution M9 a été enlevée et que tous les vers ont commencé les modèles locomoteurs non liquides, démarrez le chronomètre d’essai.
      1. De façon optimale, retirez la solution M9 en une minute. Le paramètre essentiel est l’identification de la locomotion sinusoïdienne. Vers locomote différemment, par exemple thrashing plutôt que sinusoïde, lorsqu’il est dans le liquide. Démarrez la montre d’arrêt d’essai une fois que chacun des organismes expérimentaux cesse de battre.
   8. Vérifiez les plaques d’analyse toutes les 30 minutes.
      1. Pour les plaques d’analyse avec des taches bactériennes, marquer positivement les organismes s’ils atteignent le patch alimentaire sur une période de 4 h. Pour les plaques de contrôle négatives, marquer positivement les organismes s’ils ont franchi la barrière.

Representative Results

Figure 1 : Représentation visuelle des marques pour indiquer le placement de la solution en cuivre sur le dessous d’une boîte de Pétri de 5 cm. Ces indications sont utilisées pour s’assurer que les sections de la plaque ont été mesurées de façon appropriée et servent de ligne directrice lors du transfert de la tache bactérienne, puis de la solution de cuivre sur la surface de l’agar.

Figure 2 : La boîte de Pétri de 5 cm est divisée en deux sections pour les assiettes d’analyse des aliments et une pelouse bactérienne est formée au centre d’une de ces sections pour l’assiette sur nourriture. Le patch alimentaire ne doit pas entrer en contact avec le composé d’essai qui borde les bords de l’assiette et forme une barrière médiane.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M