C. elegans Saggio chemiotassi: un metodo per testare la chemiosensinazione nei vermi

Overview

Questo video introduce la chemiotassi nel nematode C. elegans e mostra un protocollo di esempio che testa l'avversione chemiotattica al solfato di rame.

Protocol

Il seguente protocollo è un estratto da Campbell et al, A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp.

1. Preparazione di organismi sperimentali
   1. Raccogliere 10 nematodi a fasi L4 per ceppo 24 ore prima di iniziare il test per assicurarsi che gli organismi siano giovani adulti durante il test. Per ogni mutante o nematode di controllo testato, scegliere 10 L4 (10 per il controllo e 10 per il saggio).
      1. Mantenere gli organismi L4 utilizzando metodi standard per 24 ore su piastre di agar standard sementi con OP50 Escherichia coli. Se gli organismi vengono persi durante le fasi di lavaggio successive, compensare aumentando la dimensione iniziale delcampione (cioè raccogliere 20 vermi anziché 10).
         NOTA: Il comportamento è un fenotipo innatamente variabile. Eseguire il metodo in triplice copia per ogni ceppo in tre giorni separati. Includere ulteriori tensioni di controllo e condizioni per nuovi ceppi, come evidenziato nella sezione discussione.
   2. Immediatamente prima del test, trasferire organismi sperimentali su una piastra di agar senza batteri e consentire ai nematodi di muoversi liberamente per 1 minuto per rimuovere i batteri in eccesso.
      1. Se gli organismi sperimentali hanno sperimentato condizioni di contaminazione durante le 24 ore precedenti il test, scartarli.
   3. Pipetta 1 ml di M9 sulla piastra priva di batteri per lavare i vermi in un tubo di microcentrifugo.
   4. Centrifuga a 3.000 x g per 1 min. I vermi dovrebbero formare un pellet nella parte inferiore del tubo. Aspirare la soluzione M9 senza interrompere il pellet di verme. Aggiungere 1 ml di M9 al pellet di verme, invertire il tubo per mescolare i vermi con la soluzione.
   5. Ripetere i passaggi 1.4 altre tre volte.
      1. Se i batteri in eccesso sono stati inizialmente trasferiti con i vermi, ripetere per un totale di 5 volte. Nessun batterio deve essere trasferito sulle piastre di gara del cibo di rame. Se il cibo viene trasferito nella piastra di dosaggio, interferirà con una raccolta accurata dei dati.
   6. Dopo il lavaggio finale, aspirare il supernatante fino a 100 μL di M9 e il pellet di verme rimane.
      Attenzione: i comportamenti correlati alla fame diventano evidenti dopo 30 minuti. Di conseguenza i vermi devono essere immediatamente trasferiti dalla soluzione una volta completati i passaggi di lavaggio.
2. Preparazione di piastre di dosaggio
   1. Preparare le piastre di agar NGM standard due giorni prima del test.
      1. Se le piastre sono conservate in un ambiente umido, preparare piatti di agar 3 giorni prima del test. In alternativa, rimuovere il coperchio della piastra per 3 - 6 ore per garantire una corretta secchezza (se in un ambiente sterile).
   2. Con uno spesso marcatore permanente, fare una linea sul lato inferiore della piastra lungo il bordo esterno e un altro per formare una barriera di linea media (Figura 1). La barriera di linea media dovrebbe essere equidistante da ogni bordo della piastra. Utilizzare un righello per garantire misurazioni precise. Queste linee serviranno da guida quando si trasferiscono batteri e la soluzione di rame. A condizione che E. coli venga trasferito prima della soluzione di rame, queste linee fungeranno da indicatori.
   3. Piastra di semi con 50 μL di OP50 E. coli su un solo lato della barriera di rame per creare un prato uniforme (Figura 2). La concentrazione batterica deve rimanere coerente tra i saggi; tuttavia, è stata osservata poca variabilità in risposta a lievi differenze di concentrazione.
      1. Utilizzare le linee contrassegnate sul lato inferiore della piastra per assicurarsi che i batteri non vengano a contatto con la soluzione di rame. A condizione che la soluzione di rame linee il bordo della piastra e fori una barriera di linea media, trasferire i batteri in modo che la soluzione di rame non venga a contatto con la fonte di cibo.
   4. Contrassegnare una seconda serie di piastre e non trasferirle OP50 E. coli (Figura 2). Queste piastre serviranno a valutare il controllo negativo. Queste piastre dovrebbero anche avere una marcatura su una metà della piastra per indicare l'origine iniziale del trasferimento.
   5. Lasciare asciugare i batteri e poi incubare le piastre a 37 °C durante la notte. Assicurarsi che le macchie batteriche non siano disturbate durante il trasferimento in un incubatore o in una stanza a 37 °C. Un disturbo eccessivo potrebbe alterare la posizione o la forma del cerotto alimentare.
3. Saggio chemiotassi
   1. Preparare al momento una soluzione di solfato di rame (II) da 0,5 M prima dell'ora di inizio del dosaggio. A condizione che si usino 125 μL della soluzione per piastra, aumentare questo volume in funzione del numero di piastre di dosaggio utilizzate(ad esempio 5 piastre di dosaggio, 625 μL).
   2. Pipetta 100 μL della soluzione solfato di rame (II) sul bordo dell'agar per creare una barriera esterna al rame. La parte inferiore contrassegnata della piastra dovrebbe servire da guida.
   3. Pipetta 25 μL della soluzione solfato di rame (II) per creare una barriera di linea mediana.
      1. Assicurarsi che la soluzione di solfato di rame (II) non venga a contatto con il cerotto batterico. Usa una tecnica maculata poiché lo striature può influenzare la locomozione a causa di rientranze / graffi sull'agar.
   4. Lasciare asciugare la soluzione di rame sulla piastra. Il periodo di tempo può variare a seconda delle condizioni della piastra e del laboratorio. Controllare visivamente la secchezza ogni 5 minuti dopo il trasferimento.
      NOTA: La soluzione in rame mostra una tinta bluastra ed è facilmente identificabile. Utilizzare un tessuto da laboratorio per tamponare leggermente la soluzione vicino al bordo della piastra per discernere la secchezza.
   5. Pipetta 20 μL del pellet di verme dal fondo del tubo sulla metà priva di batteri della piastra di dosaggio.
      1. Assicurarsi che 10 vermi vengano trasferiti sulla piastra di dosaggio. Se i vermi extra sono stati accidentalmente inclusi, rimuoverli raccogliendo con olio di alocarbonio per assicurarsi che non vengano aggiunti batteri alla piastra. Ogni saggio deve avere un numero consistente di nematodi durante il saggio.
         NOTA: Se vengono trasferiti troppo pochi vermi durante i test, l'aumento della dimensione iniziale del campione attenuerà le potenziali perdite durante i lavaggi e i trasferimenti.
   6. Rimuovere l'eccesso di M9 dalla piastra con un tessuto di laboratorio. M9 non deve entrare in contatto con la soluzione di solfato di rame (II).
      Attenzione: assicurarsi che i vermi e la superficie dell'agar rimangano inalterati durante l'esecuzione di questo passaggio. Se usato troppo duramente, il tessuto di laboratorio può creare rientranze sulla superficie dell'agar della piastra e può rimuovere i vermi. I worm rimossi accidentalmente tramite KimWipe devono essere scartati.
   7. Una volta rimossa la soluzione M9 e tutti i vermi hanno iniziato modelli locomotori non liquidi, avviare il cronometro di dosaggio.
      1. In modo ottimale, rimuovere la soluzione M9 entro un minuto. Il parametro essenziale è l'identificazione della locomozione sinusoidale. I vermi locomoti in modo diverso, ad esempio thrashing piuttosto che sinusoidale, quando sono in liquido. Inizia il test stop watch una volta che ciascuno degli organismi sperimentali smette di trashing.
   8. Controllare le targhe di dosaggio ogni 30 minuti.
      1. Per le piastre di dosaggio con macchie batteriche, segnare positivamente gli organismi se raggiungono il cerotto alimentare per un periodo di 4 ore. Per le piastre di controllo negative, segnare positivamente gli organismi se hanno superato la barriera.

Representative Results

Figura 1: Una rappresentazione visiva delle marcature per indicare il posizionamento della soluzione di rame sul lato inferiore di una piastra di Petri di 5 cm. Queste indicazioni vengono utilizzate per garantire che le sezioni della piastra siano state misurate in modo appropriato e funa da linea guida quando si trasferisce il cerotto batterico e quindi la soluzione di rame sulla superficie dell'agar.

Figura 2: La piastra di Petri di 5 cm è divisa in due sezioni per piastre di dosaggio degli alimenti e si forma un prato batterico al centro di una di queste sezioni per la piastra alimentare. Il cerotto alimentare non deve entrare in contatto con il composto di prova che lineeggia i bordi della piastra e forma una barriera di linea mediana.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M