C. elegans Kemotaksi Testi: Solucanlarda Kemosentasyonu Test Etmek İçin Bir Yöntem

Overview

Bu video nematod C. elegans kemotaxis tanıtır ve bakır sülfat için kemotaktik nefret test örnek bir protokol gösterir.

Protocol

Aşağıdaki protokol Campbell ve ark. A Caenorhabditis elegans Nutrition-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017)'den bir alıntıdır.

1. Deneysel Organizmaların Hazırlanması
   1. Organizmaların test edildiğinde genç yetişkinler olduğundan emin olmak için teste başlamadan önce 24 saat boyunca suş başına 10 L4 aşamalı nematod seçin. Test edilen her mutant veya kontrol nematodu için 10 L4 (kontrol için 10 ve test için 10) seçin.
      1. OP50 Escherichia coliile tohumlanmış standart agar plakalarında 24 saat boyunca standart yöntemler kullanarak L4 organizmalarını koruyun. Sonraki yıkama adımları sırasında organizmalar kaybolursa, başlangıç numune boyutunu artırarak telafi edin(yani 10 yerine 20 solucan seçin).
         NOT: Davranış doğuştan değişken bir fenotiptir. Yöntemi üç ayrı günde her suş için üç taraflı olarak gerçekleştirin. Tartışma bölümünde vurgulandığı gibi, yeni suşlar için ek kontrol suşları ve koşulları ekleyin.
   2. Testten hemen önce, deneysel organizmaları bakteri içermeyen bir agar plakasına aktarın ve nematodların fazla bakterileri gidermek için 1 dakika boyunca serbestçe hareket etmesine izin verin.
      1. Deneysel organizmalar tahlilden önceki 24 saat boyunca kontaminasyon koşulları yaşadıysa, bunları atın.
   3. Pipet 1 mL M9, solucanları mikrosantrifüj tüpüne yıkamak için bakteri içermeyen plakaya.
   4. 1 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüj. Solucanlar tüpün dibinde bir pelet oluşturmalıdır. Solucan peletini bozmadan M9 çözeltisini aspire edin. Solucan peletine 1 mL M9 ekleyin, solucanları çözeltiyle karıştırmak için tüpü ters çevirin.
   5. 1.4 adımlarını üç kez daha yineleyin.
      1. Aşırı bakteri başlangıçta solucanlarla transfer edildiyse, toplam 5 kez tekrarlayın. Bakır gıda yarış plakalarına bakteri aktarılmamalıdır. Gıda tahlil tabağına aktarılırsa, doğru veri toplamayı kesintiye uğratacaktır.
   6. Son yıkamadan sonra, 100 μL M9'a kadar süpernatantı aspire edin ve solucan peleti kalır.
      Dikkat: Açlıkla ilgili davranışlar 30 dk sonra belirginleşir. Sonuç olarak solucanlar, yıkama adımları tamamlandıktan sonra derhal çözeltiden aktarılmalıdır.
2. Tahlil Plakalarının Hazırlanması
   1. Teste iki gün önce standart NGM agar plakaları hazırlayın.
      1. Plakalar nemli bir ortamda tutulursa, tahlilden 3 gün önce agar tabakları yapın. Alternatif olarak, uygun kuruluğu sağlamak için plakanın kapağını 3 - 6 saat boyunca çıkarın (steril bir ortamda ise).
   2. Kalın bir kalıcı işaretleyici ile, plakanın alt tarafında dış kenar boyunca bir çizgi yapın ve orta çizgi bariyeri oluşturmak için başka bir çizgi yapın (Şekil 1). Orta çizgi bariyeri plakanın her kenarından eşitlikçi olmalıdır. Hassas ölçümler sağlamak için bir cetvel kullanın. Bu hatlar bakterileri ve bakır çözeltisini aktarırken bir rehber görevi görecektir. E. coli'nin bakır çözeltisinden önce aktarılması koşuluyla, bu hatlar gösterge görevi görecektir.
   3. Tek tip çim oluşturmak için bakır bariyerin sadece bir tarafında 50 μL OP50 E. coli içeren tohum plakası (Şekil 2). Bakteriyel konsantrasyon tahliller arasında tutarlı kalmalıdır; bununla birlikte, konsantrasyondaki hafif farklılıklara yanıt olarak çok az değişkenlik gözlenmiştir.
      1. Bakterilerin bakır çözelti ile temas etmemesini sağlamak için plakanın alt tarafındaki işaretli çizgileri kullanın. Bakır çözeltinin plakanın kenarını kaplaması ve orta hat bariyeri oluşturursa, bakterileri bakır çözeltisinin besin kaynağıyla temas etmeyecek şekilde aktarın.
   4. İkinci bir plaka setini işaretleyin ve OP50 E. coli'yi onlara aktarmayın (Şekil 2). Bu plakalar negatif kontrolü değerlendirmeye hizmet edecektir. Bu plakalar ayrıca ilk transfer kaynağını belirtmek için plakanın bir yarısında bir işarete sahip olmalıdır.
   5. Bakterilerin kurumasını bekleyin ve plakaları bir gecede 37 °C'de kuluçkaya bırakın. 37 °C inkübatöre veya odaya aktarırken bakteri yamalarının bozulmadığından emin olun. Aşırı rahatsızlık, yemek yamasının yerini veya şeklini değiştirebilir.
3. Kemotaksi Tahlili
   1. Test başlangıç saatinden önce 0,5 M bakır (II) sülfat çözeltisini yeni hazırlayın. Çözeltinin plaka başına 125 μL kullanılması koşuluyla, kullanılan test plakalarının sayısına bağlı olarak bu hacmi ölçeklendirin(örneğin 5 tahlil plakası, 625 μL).
   2. Pipet 100 μL bakır (II) sülfat çözeltisi agar kenarında dış bakır bariyer oluşturmak için. Plakanın işaretli alt kısmı kılavuz görevi görmelidir.
   3. Pipet 25 μL bakır (II) sülfat çözeltisi orta hat bariyeri oluşturmak için.
      1. Bakır (II) sülfat çözeltisinin bakteri yaması ile temas etmediğine emin olun. Agar üzerindeki girintiler / çizikler nedeniyle çizgileme hareket etmeyi etkileyebileceği için benekli bir teknik kullanın.
   4. Bakır çözeltinin plaka üzerine kurumasını bekleyin. Zaman süresi plaka ve laboratuvar koşullarına bağlı olarak değişebilir. Transferden sonra her 5 dakikada bir kuruluk olup olmadığını görsel olarak kontrol edin.
      NOT: Bakır çözelti mavimsi bir renk tonu görüntüler ve kolayca tanımlanabilir. Kuruluğu ayırt etmek için çözeltiyi plakanın kenarına yakın hafifçe dablamak için bir laboratuvar dokusu kullanın.
   5. Pipet 20 μL solucan pelet tüpün dibinden test plakasının bakteri içermeyen yarısına.
      1. 10 solucanın test plakasına aktarıldığından emin olun. Yanlışlıkla ekstra solucanlar dahil edildiyse, plakaya bakteri eklenmediklerinden emin olmak için halokarbon yağı ile toplayarak çıkarın. Her tahlil sırasında tutarlı sayıda nematod olmalıdır.
         NOT: Tahliller sırasında çok az solucan transfer edilirse, ilk numune boyutunun artırılması yıkama ve transferler sırasında olası kayıpları azaltacaktır.
   6. Fazla M9'ı bir laboratuvar dokusu ile plakadan çıkarın. M9 bakır (II) sülfat çözeltisi ile temas etmemelidir.
      Dikkat: Bu adımı gerçekleştirirken solucanların ve agar yüzeyinin etkilenmeden kaldığından emin olun. Çok sert kullanılırsa, laboratuvar dokusu plakanın agar yüzeyine girintiler oluşturabilir ve solucanları temizleyebilir. KimWipe aracılığıyla yanlışlıkla çıkarılan solucanlar atılmalıdır.
   7. M9 çözeltisi çıkarıldıktan ve tüm solucanlar sıvı olmayan lokomotory desenlere başladıktan sonra, test kronometresini başlatın.
      1. En iyi şekilde, M9 çözeltisini bir dakika içinde çıkarın. Temel parametre sinüzoidal locomotion'ın tanımlanmasıdır. Solucanlar farklı bir şekilde locomote, örneğin sinüzoidal yerine dayak, sıvı olduğunda. Deney organizmalarının her biri kırbaçlamayı bıraktığında tahlil durdurma nöbetini başlatın.
   8. Her 30 dakikada bir test plakalarını kontrol edin.
      1. Bakteriyel yamalara sahip test plakaları için, 4 saat boyunca gıda yamasına ulaşırlarsa organizmaları olumlu bir şekilde puanlayın. Negatif kontrol plakaları için, bariyeri geçtilerse organizmaları olumlu bir şekilde puanlayın.

Representative Results

Şekil 1: 5 cm Petri Kabının Alt Kısmına Bakır Çözelti Yerleşimini Gösteren İşaretlerin Görsel Gösterimi. Bu endikasyonlar, plakanın bölümlerinin uygun şekilde ölçüldüğünden emin olmak için kullanılır ve bakteri yamasını ve ardından bakır çözeltiyi agar yüzeyine aktarırken bir kılavuz görevi gördüğünden emin olmak için kullanılır.

Şekil 2: 5 cm Petri Kabı, Gıda Test Tabakları Açık ve Kapalı İçin İki Bölüme Ayrılmıştır ve Gıda Tabağı İçin Bu Bölümlerden Birinin Merkezinde Bakteriyel Bir Çim Oluşur. Gıda yaması, plakanın kenarlarını hizalayan ve orta çizgi bariyeri oluşturan test bileşiği ile temas olmamalıdır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M