Ensayo electrotaxis: un método para observar la locomoción en C. elegans

Overview

Los investigadores pueden desencadenar el movimiento bajo demanda en C. elegans mediante la aplicación de un campo eléctrico que los gusanos detectan y responden.  Este video introduce el comportamiento electrotáctico y muestra un protocolo de muestra que se realiza en un dispositivo microfluídico.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Tong et al, Electrotaxis basado en Microfluidic para análisis cuantitativo bajo demanda de Caenorhabditis elegans' Locomoción, J. Vis. (2013).

1. Experimento de electrotaxis

1. Coloque el microcanal en el escenario (preferiblemente móvil XY) de un microscopio con una cámara montada conectada a un monitor (Figura 1).
2. Conecte la fuente de alimentación o los cables de salida del amplificador a los electrodos del microcanal. Una fuente de alimentación de CC simple es suficiente si sólo se desea una señal de CC, pero un amplificador conectado a un generador de funciones permite la aplicación de señales de CC y CA pulsadas también.
3. Conecte el tubo de salida del microcanal a una jeringa desechable. Sumerja la boca del tubo de entrada en el amortiguador fisiológico M9 y aspire suavemente el líquido al canal aplicando una presión negativa dentro de la jeringa (ya sea manualmente o utilizando una bomba de jeringa). Cuando los tubos de entrada y salida estén llenos de M9, desconecte la jeringa del tubo. Nivele ambos tubos a la misma altura para evitar el flujo accionado hidrostáticamente.
4. Aplique una tensión de CC al canal y asegúrese de que la resistencia (R= V/I) sea de alrededor de 0,6 MΩ (para un microcanal de 50 mm de largo, 0,3 mm de ancho y ~0,1 mm de profundidad).
5. Si está satisfecho con la integridad del canal, siga los pasos anteriores para cargar gusanos de una suspensión diluida en el canal.
6. Desconecte la jeringa y manipule hidrostáticamente el flujo ajustando la altura relativa de los tubos. Utilice este método para colocar un gusano en el centro del canal y, a continuación, coloque ambos tubos planos a la misma elevación.
7. Ajuste la fuente de alimentación a la tensión adecuada: 4-12 V/cm para animales de etapa L3, 4-10 V/cm para L4s y 2-4 V/cm para adultos jóvenes. Active la señal eléctrica y deje que 1 minuto de preexposición del gusano se aclimata al campo. El gusano debe comenzar a moverse hacia el cátodo. Cuando haya pasado el minuto, utilice la cámara para comenzar a grabar.
8. Para los experimentos de CA y CC pulsado, el campo eléctrico máximo sensible se puede adoptar desde arriba y la frecuencia y el ciclo de trabajo de la señal se pueden modular según lo desee.
9. Cuando termine el experimento, retire todo el líquido (y gusanos) del canal, enjuáguelo con dH₂0 y deje el dispositivo en una placa caliente a 125 °C para secar.
10. Extraiga datos locomotores de vídeos grabados manualmente utilizando NIH ImageJ(http://rsbweb.nih.gov/ij/)o software personalizado de seguimiento de gusanos basado en MATLAB.

Representative Results

Figura 1. Esquema de plataforma de cribado microfluídico para ensayo de electrotaxis de nematodos.