К. Элеганс Отслеживание движения: метод оценки передвижения червей

Overview

Это видео описывает использование видео и отслеживания программного обеспечения для записи червя движения на арене.  Пример протокола измеряет влияние воздействия этанола на движение червя.

Protocol

Следующий протокол является выдержка из Дэвис и др.,анализдля измерения воздействия этанола на locomotion Скорость Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015). 

1. Шаги для выполнения за день до анализа

   1. Выберите L4 этапе червей для свежих нематод роста среды (NGM) пластин, посеянных с газоном OP50 кишечной палочки, и культуры их при 20 C O / N. Каждое состояние анализа требует 10 червей; выбрать избыток червей, чтобы для O / N потери червей.
      1. Только анализ животных, которые являются взрослыми первого дня; многие мутанты растут с более низкой скоростью, чем дикий тип. Отрегулируйте время сбора штаммов, которые имеют задержки в развитии, так что все животные испытания первого дня взрослых.
2. Шаги для выполнения в День анализа
   1. Подготовка к анализу:
      1. Выполните анализы на стандартных несеяных пластинах 60 x 15 мм NGM. Высушите все пластины, которые будут использоваться при 37 градусов по Цельсию в течение 2 часов, с крышками. Для каждого экспериментального исследования используйте четыре сушеные пластины NGM; это будут 0 мМ и 400 мМ этанола анализ пластин и сопровождающих их акклиматизации пластин.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь важно использовать NGM-таблички; Различия в составе пластин, в частности их осмолярность, могут сильно повлиять на дозовую реакцию этанола на поведение, это связано, по крайней мере частично, с изменениями количества этанола, накопленного животными. NGM агар составляет 160 мОм.
      2. После высыхания взвесьте каждую из несеяных пластин NGM, которые будут использоваться в анализе, и обратите внимание на вес. Определите объем мультимедиа в пластинах на основе веса пустой пластины. Чтобы приблизить преобразование веса агара в объем, предположим, что средства массовой информации весит так же, как равный объем воды.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Наши наиболее последовательные результаты были найдены с NGM сми, которые обезвоживают достаточно, что оригинальный объем 10 мл имеет пост-сушки объем между 8,3 -8,9 мл. Альтернативой сухому времени в 2 часа является высыхание до тех пор, пока пластины не достигнут этого объема, чтобы учесть различия в инкубаторах.
      3. Растопить 4 медных кольца (внутренний диаметр 1,6 см) на поверхности каждой из пластин, чтобы выступать в качестве загона для различных генотипов или групп лечения червей. Возьмите каждое кольцо с типсами, и тепло в пламени (сильное пламя от горелки Bunsen работает хорошо) в течение примерно 3 сек. Немедленно поместите кольцо на тарелку, все еще держа кольцо с типсами, чтобы предотвратить его от "пропуска".
         1. Убедитесь, что кольцо лежит плашмя против поверхности агара, нажав вниз мягко с типсами в нескольких точках на кольце. При размещении кольца, будьте осторожны, чтобы оставить место для дополнительных трех колец.
         2. Растопить три дополнительных медных кольца на поверхности пластины, заботясь, чтобы поместить их как можно ближе друг к другу, так что все четыре будут в поле зрения камеры.
            ПРИМЕЧАНИЕ: Создание хорошего уплотнения с агаром имеет важное значение для держать червей в кольцах во время анализа. Кольца, которые пропускают вокруг на пластине вряд ли сделать правильный уплотнения с агаром и может шрам агар, который позволяет червей норы и мешает визуализации червей.
         3. Для каждой анализной пластины приготовьте сопроводительную «акклиматизацию» пластины, которая должна быть высушена и несеяной и не получит этанола. Поместите четыре медных кольца на эти пластины.
      4. Этикетка нижней части пластин рядом с каждым кольцом с червя штамма, которые будут использоваться в кольцо, заботясь, чтобы не писать в поле зрения самого кольца. Матч этикетки на анализ пластины с сопровождающей акклиматизации пластины.
      5. Рассчитайте количество 100% этанола, чтобы добавить к каждой анализной пластине так, чтобы окончательная концентрация составила 0 мМ или 400 мМ этанола (вес к объему). Для каждого эксперимента(n No 1) будет одна пластина этанола 0 мМ и одна пластина этанола 400 мМ; акклиматизные пластины не получают этанола. Добавить этанол, трубя его вокруг поверхности пластины. Используйте лабораторную пленку, чтобы запечатать пластину и дать ей эквилибрировать на скамейке верхней в течение 2 часов.
      6. По протяжив 1,5 часа, начните акклиматизационный этап анализа, шаг 2.2.
   2. Выполните локомотивный анализ: Анализ пластин
      1. Тщательно перенесите по 10 червей каждой экспериментальной группы в центр медного кольца на акклиматионные пластины. Удалите любую пищу, которая видна на агаре в этот момент, соскоб осторожно с червя забрать. Измените порядок, в котором экспериментальные группы ставятся на пластины в ходе экспериментальных испытаний, так что те же штаммы не ставятся на пластины в том же порядке через испытания.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы передать животных на тарелку с минимальным количеством пищи, потому что если пища на акклиматизации пластины передается на анализ пластины черви будут агрегировать вокруг пищи и влияние препарата на передвижение будет скрыто.
      2. Будьте осторожны, чтобы не сломать поверхность агара с забрать, так как это позволит червей норы и нарушит анализ. Инкубировать червей на RT в течение 30 минут.
      3. Убедитесь, что между инициациями каждой пластины существует соответствующий интервал. Опытный экспериментатор может перемещать 40 животных, 10/кольцо на 4 кольца в Lt; 1,5 мин, но любой интервал до 2 мин является приемлемым. Стандартный анализ имеет записи фильмов на 10-12 мин и 30-32 мин экспозиции для 0 мМ и 400 мМ этанола.
      4. Инициировать акклиматизацию пластины для воздействия 0 мМ и акклиматизации пластины для 400 мМ воздействия примерно 2 мин и 30 сек друг от друга, чтобы обеспечить сохранение первого файла фильма до начала второго фильма.
      5. После 30-минутного периода акклиматизации перенесите червей с акклиматизных пластин на анализные пластины. Перенесите червей на анализные пластины (0 мМ или 400 мМ этанола) в том же порядке, что они были добавлены в акклиматизационные пластины, отслеживая сроки между завершениями каждой пластины. Печать пластины с лабораторной пленкой, чтобы свести к минимуму потерю этанола для испарения.
      6. Используйте черпая движение с тонкими краями сплющенный червь забрать для сбора червей на вершине сплющенный забрать. Выполните передачу червей из несеяной акклиматизации пластины на анализ пластины без использования бактерий, которые обычно используются в передаче червей, как это помогает склеить червя на выбор.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость, с которой животные передаются на этом этапе очень важно, потому что первые черви на пластине будут подвергаться воздействию этанола дольше, чем последние черви, добавленные в тарелку, и ранее точки времени могут показать некоторые зависящие от времени эффекты. Это основная причина для вращать которые напряжения помещены на плите сперва через экспериментальные репликации.
   3. Выполните Locomotion Assay: Съемки
      1. Используйте комбинацию микроскопа/камеры, которая позволяет одновременно изображения всех четырех колец в поле зрения (примерно 42x42 мм² квадратных), таких как 0,5x микроскоп цели, 0,8x увеличение и камера с 2048x2048 7,4 мкм пикселя CCD.
      2. Используйте даже освещение в поле зрения, что способствует распознаванию объектов на пороговом этапе интенсивности. 3 "x3" подсветка работает хорошо.
      3. Изображение червей на пластине расположены медиа-стороны вверх (крышка вниз), который генерирует контраст, который теряется при использовании подсветки по сравнению с традиционным микроскопом передается источник света.
      4. Подготовье программного обеспечения для анализа изображений, чтобы запечатлеть фильмы о движущихся червях. Установите программное обеспечение для захвата 12-битных изображений серого масштаба каждые 1 сек, как 2-минутный (120 кадр) фильм. Чтобы уменьшить размер вывода файла, сохраняя при этом достаточное разрешение изображения, используйте режим 2x2 binning для захвата изображений пикселей 1024x1024.
      5. Запись фильмов. Начните запись 120-кадр фильм первой пластины (0 мМ этанола) 10 минут после того, как последние черви были помещены на этой пластине. Сохраните файл фильма.
      6. Запись второй пластины (400 мМ этанола). Повторите этот процесс для обеих пластин, начиная 30 минут после того, как последние черви были помещены на первой пластине (0 мМ этанола), чтобы захватить 30-32 мин точек времени для каждой экспозиции.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте достаточно времени для сохранения файлов изображения после каждого сеанса захвата перед началом записи следующей пластины для анализа.
      7. Для будущей проверки архивных фильмов и для того, чтобы эти фильмы были открыты и проанализированы другими программами с открытым исходным кодом с открытым исходным кодом, такими как ImageJ, преобразуйте копию каждого фильма в 8-битные 256 файлов TIFF серой шкалы.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для анализа изображений, описанное здесь, использует собственный формат файлов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.