C. 埃莱甘斯 运动跟踪：评估蠕虫运动的方法

Overview

此视频描述了使用视频和跟踪软件来记录竞技场上的蠕虫运动。 示例协议测量乙醇暴露对蠕虫运动的影响。

Protocol

下列协议是戴维斯等人的摘录，《测量乙醇对卡诺哈布迪蒂斯电子教徒运动速度的影响的分析》，J.Vis. Exp。(2015). 

1. 在分析前一天执行的步骤

   1. 挑选L4阶段蠕虫到新鲜线虫生长介质（NGM）板播种与OP50大肠杆菌的草坪，并在20°C O/N培养他们。每个检测条件需要10个蠕虫：选择多余的蠕虫，使蠕虫的O/N损失。
      1. 只检测第一天成人的动物;许多突变体的生长速度比野生类型慢。调整采摘有发育延迟的菌株的时间，以便所有接受测试的动物都是第一天的成年人。
2. 在分析日执行的步骤
   1. 分析准备：
      1. 在标准非种子 60 x 15 mm NGM 板上执行检测。干燥所有板，在37°C使用2小时，盖子关闭。对于每个实验试验，使用四个干燥的NGM板：这些将是 0 mM 和 400 mM 乙醇检测板及其附带的适应板。
         注： NGM板的使用在这里很重要：板块成分的差异，特别是其渗透性，会强烈地影响乙醇对行为的剂量反应，这至少部分是由于动物积累的乙醇量的变化。NGM阿加是160米。
      2. 干燥后，称重用于检测的每个非种子 NGM 板，并注意重量。根据空板的重量确定板中的介质体积。要将 agar 的重量转换为体积，假设介质的重量与等量的水相同。
         注： 我们最一致的结果已经发现与NGM介质已经脱水足够，原来的10毫升体积有8.3-8.9毫升之间的干燥后体积。2 小时干燥时间的替代方案是干燥，直到板达到此体积范围，以解释孵化器的差异。
      3. 将 4 个铜环（内径 1.6 厘米）融化到每个板的表面，作为不同基因型或蠕虫治疗组的胸围。用钳子抓住每个环，在火焰中加热（Bunsen 燃烧器中的强火焰效果良好）大约 3 秒。立即将戒指放在盘子上，同时仍用钳子握住戒指，以防止戒指"跳过"。
         1. 通过在环上的几个点上用钳子轻轻向下按压，确保戒指平放在阿加表面。放置戒指时，请小心留出空间，再放置三枚戒指。
         2. 将另外三个铜环熔化到板的表面，注意将它们尽可能靠近在一起，以便所有四个铜环都位于摄像机的视野中。
            注： 在检测过程中，用 agar 制作良好的密封件对于将蠕虫保存在环中至关重要。在盘子上跳来跳去的环不太可能用阿加做正确的密封，并可能疤痕的阿加，这允许蠕虫挖洞和干扰可视化蠕虫。
         3. 对于每个检测板准备一个附带的"适应"板，应干燥和非种子，不会收到乙醇。在这些盘子上放置四个铜环。
      4. 将每个环旁边的板底部贴有用于环中的蠕虫菌株，注意不要在环本身的视野中书写。将检测板上的标签与其附带的适应板匹配。
      5. 计算添加到每个检测板中的 100% 乙醇量，使最终浓度为 0 mM 或 400 mM 乙醇（重量到体积）。对于每个实验（n = 1），将有一个0mM和一个400m乙醇板：升华板不接收乙醇。加入乙醇，在盘子表面吹管。使用实验室膜密封板，并允许它在台上平衡2小时。
      6. 当 1.5 小时过去时，开始测定的适应步骤，步骤 2.2。
   2. 执行运动测定：测定板
      1. 小心地将每个实验组的10个蠕虫转移到适应板上的铜环中心。此时，通过用蠕虫采摘轻轻刮取，去除在 agar 上可见的任何食物。改变实验组在实验试验中放在板上的顺序，以便在试验中不按相同的顺序将相同的菌株放在板上。
         注： 目标是以最少的食物将动物转移到盘子里，因为如果适应板上的食物被转移到检测板上，蠕虫就会聚集在食物周围，药物对运动的影响就会被掩盖。
      2. 小心不要用挑子打破阿加的表面，因为这样会让蠕虫挖洞，并会破坏检测。在 RT 孵化蠕虫 30 分钟。
      3. 确保每个板的启动之间有适当的间隔。经验丰富的实验者可以移动40只动物，10/环4环在<1.5分钟，但任何间隔长达2分钟是可以接受的。标准检测具有电影记录在10-12分钟和30-32分钟的曝光0 mM和400m乙醇。
      4. 启动 0 mM 曝光的适应板和 400 mM 曝光的适应板，间隔约 2 分钟 30 秒，以便在第二部电影开始前保存第一个电影文件。
      5. 在 30 分钟的适应期后，将蠕虫从适应板转移到检测板。将蠕虫转移到检测板（0 mM 或 400 mM 乙醇）中，顺序与添加到适应板中的顺序相同，跟踪每个板完成之间的时间。用实验室膜密封板，以尽量减少乙醇蒸发损失。
      6. 使用带有薄边扁平蠕虫采摘的铲取运动，在扁平的拾取物顶部收集蠕虫。执行蠕虫从非种子适应板转移到检测板，而不使用细菌，这是通常用于转移蠕虫，因为它有助于粘合蠕虫到采摘。
         注： 动物在这一步的转移速度是非常重要的，因为板上的第一个蠕虫将暴露在乙醇比最后一个蠕虫添加到板中更长的时间，和早期的时间点可能会显示一些时间依赖的影响。这是旋转的主要原因，其中菌株首先放置在一个板上，首先跨越实验复制品。
   3. 执行运动分析：拍摄
      1. 使用显微镜/摄像机组合，允许同时成像视野中的所有四个环（约 42x42 mm²平方），例如 0.5 倍显微镜目标、0.8 倍放大倍数和带 2048x2048 7.4 μm 像素 CCD 的摄像机。
      2. 在整个视野中使用偶数照明，这有助于在强度阈值步骤时识别对象。3"x3"背光工作得很好。
      3. 将蠕虫放在板上（盖子向下）上，与传统的显微镜传输光源相比，使用背光时会产生丢失的对比度。
      4. 准备图像分析软件，以捕获移动蠕虫的延时电影。将软件设置为每 1 秒捕获 12 位灰度图像，作为 2 分钟（120 帧）电影。要缩小输出文件的大小，同时仍保留足够的图像分辨率，请使用 2x2 绑定模式捕获 1024x1024 像素图像。
      5. 录制电影。开始录制第一个板 （0 mM 乙醇） 的 120 帧电影 10 分钟后， 最后一个蠕虫被放置在该板上。保存电影文件。
      6. 记录第二个板（400 mM乙醇）。在最后一个蠕虫被放置在第一个板 （0 mM 乙醇） 上 30 分钟后，对两个板重复此过程，以捕获每次接触的 30-32 分钟时间点。
         注： 在开始录制要分析的下一个板之前，在每次捕获会话后留出足够的时间来保存图像文件。
      7. 为了面向未来的存档电影，并允许这些电影由其他公有领域开源成像软件程序（如 ImageJ）打开和分析，请将每部电影的副本转换为 8 位 256 灰色比例 TIFF 文件。
         注： 此处描述的图像分析软件使用专有的文件格式。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.