C. elegans Suivi des mouvements : une méthode pour évaluer la locomotion chez les vers

Overview

Cette vidéo décrit l’utilisation d’un logiciel de vidéo et de suivi pour enregistrer le mouvement des vers dans une arène.  Le protocole d’exemple mesure l’effet de l’exposition à l’éthanol sur la locomotion des vers.

Protocol

Le protocole suivant est un extrait de Davies et coll., An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).

1. Étapes à effectuer la veille de l’essai

   1. Choisissez des vers de stade L4 dans des plaques fraîches de croissance des nématodes (NGM) ensemencées d’une pelouse d’OP50 E. coliet culturez-les à 20 °C O/N. Chaque condition d’analyse nécessite 10 vers; choisir un excès de vers pour permettre la perte d’O/N de vers.
      1. Seuls les animaux d’essai qui sont des adultes du premier jour; de nombreux mutants poussent à une vitesse plus lente que le type sauvage. Ajuster le moment de la cueillette pour les souches qui ont des retards de développement afin que tous les animaux testés soient des adultes du premier jour.
2. Étapes à effectuer le jour de l’essai
   1. Préparation pour l’essai:
      1. Effectuez des analyses sur des plaques NGM standard non enseillées de 60 x 15 mm. Séchez toutes les plaques à utiliser à 37 °C pendant 2 heures, les couvercles éteints. Pour chaque essai expérimental, utilisez quatre plaques NGM séchées; il s’agira des plaques d’analyse d’éthanol de 0 mM et de 400 mM et des plaques d’acclimation qui les accompagnent.
         REMARQUE: L’utilisation des plaques NGM est importante ici; les différences dans la composition des plaques, en particulier leur osmolarité, peuvent fortement affecter la réponse de dose d’éthanol sur le comportement, ceci est dû, au moins en partie, aux changements dans la quantité d’éthanol accumulée par les animaux. L’agar NGM est de 160 mOsm.
      2. Après séchage, pesez chacune des plaques NGM non enseillées à utiliser dans l’analyse et notez le poids. Déterminer le volume de supports dans les plaques en fonction du poids d’une plaque vide. Pour rapprocher la conversion du poids de l’agar en volume, supposons que les médias pèsent la même chose qu’un volume égal d’eau.
         REMARQUE: Nos résultats les plus cohérents ont été trouvés avec des supports NGM qui se sont suffisamment déshydratés pour qu’un volume original de 10 ml ait un volume post-séchage compris entre 8,3 et 8,9 ml. Une alternative au temps sec de 2 heures est de sécher jusqu’à ce que les plaques atteignent cette plage de volume pour tenir compte des différences dans les incubateurs.
      3. Faire fondre 4 anneaux de cuivre (diamètre intérieur de 1,6 cm) à la surface de chacune des plaques pour agir comme corrals pour les différents génotypes ou groupes de traitement des vers. Saisir chaque anneau avec des forceps, et chauffer dans une flamme (une forte flamme d’un brûleur Bunsen fonctionne bien) pendant environ 3 sec. Placez immédiatement l’anneau sur une plaque tout en tenant l’anneau avec les forceps pour l’empêcher de « sauter ».
         1. Assurez-vous que l’anneau repose à plat contre la surface de l’agar en appuyant doucement avec les forceps à plusieurs points sur l’anneau. Lorsque vous placez l’anneau, veillez à laisser de la place pour trois anneaux supplémentaires.
         2. Faire fondre les trois anneaux de cuivre supplémentaires dans la surface de la plaque, en prenant soin de les placer aussi près les uns des autres que possible afin que tous les quatre seront dans le champ de vision de la caméra.
            REMARQUE: Faire un bon joint avec l’agar est essentiel pour garder les vers dans les anneaux pendant l’essai. Les anneaux qui sautent autour de la plaque sont peu susceptibles de faire le joint correct avec l’agar et peuvent marquer l’agar, ce qui permet aux vers de creuser et interfère avec la visualisation des vers.
         3. Pour chaque assiette d’analyse, préparez une plaque d’aclimation qui l’accompagne, qui doit être séchée et non ensemennée et ne recevra pas d’éthanol. Placez quatre anneaux de cuivre sur ces plaques.
      4. Étiquetez le fond des plaques à côté de chaque anneau avec la souche de ver à utiliser dans l’anneau, en prenant soin de ne pas écrire dans le champ de vision de l’anneau lui-même. Assortir les étiquettes sur la plaque d’essai avec la plaque d’aclimation qui l’accompagne.
      5. Calculer la quantité d’éthanol à 100 % à ajouter à chaque plaque d’analyse afin que la concentration finale soit de 0 mM ou 400 mM d’éthanol (poids en volume). Pour chaque expérience(n = 1), il y aura une plaque d’éthanol de 0 mM et une plaque d’éthanol de 400 mM; les plaques d’aclimation ne reçoivent pas d’éthanol. Ajouter l’éthanol, le pipetting autour de la surface de la plaque. Utilisez un film de laboratoire pour sceller la plaque et lui permettre d’équilibrer sur le dessus du banc pendant 2 heures.
      6. Lorsque 1,5 heure s’est écoulée, commencez l’étape d’acclimation de l’essai, étape 2.2.
   2. Effectuer locomotion test: Plaques d’essai
      1. Transférer soigneusement 10 vers de chaque groupe expérimental au centre d’un anneau de cuivre sur la plaque d’acclimation. Retirez tous les aliments visibles sur l’agar à ce stade en raclant doucement avec le pic de ver. Variez l’ordre dans lequel les groupes expérimentaux sont mis sur les plaques à travers les essais expérimentaux afin que les mêmes souches ne soient pas mises sur les plaques dans le même ordre entre les essais.
         REMARQUE: L’objectif est de transférer les animaux dans l’assiette avec un minimum de quantités de nourriture, parce que si la nourriture sur la plaque d’aclimation est transférée à la plaque d’essai, les vers s’agrègeront autour de la nourriture et l’effet du médicament sur la locomotion sera obscurci.
      2. Veillez à ne pas briser la surface de l’agar avec la pioche, car cela permettra aux vers de creuser et perturbera le test. Incuber les vers à RT pendant 30 min.
      3. Assurez-vous qu’il y a un intervalle approprié entre les initiations de chaque plaque. Un expérimentateur expérimenté peut déplacer 40 animaux, 10/anneau pour 4 anneaux en < 1,5 min, mais tout intervalle jusqu’à 2 min est acceptable. L’essai standard a des films d’enregistrement à 10-12 min et 30-32 min d’exposition pour les deux 0 mM et 400 mM d’éthanol.
      4. Lancez la plaque d’acclimation pour l’exposition de 0 mM et la plaque d’aclimation pour l’exposition de 400 mM à environ 2 min et 30 sec d’intervalle pour permettre l’enregistrement du premier fichier de film avant le deuxième film doit commencer.
      5. Après la période d’acclimation de 30 min, transférer les vers des plaques d’acclimation aux plaques d’essai. Transférer les vers dans les plaques d’essai (0 mM ou 400 mM d’éthanol) dans le même ordre qu’ils ont été ajoutés à la plaque d’acclimation, en gardant une trace du moment entre les achèvements de chaque plaque. Sceller la plaque avec un film de laboratoire afin de minimiser la perte d’éthanol à la vaporisation.
      6. Utilisez un mouvement de ramassage avec un pic de ver aplati à bords minces pour recueillir les vers sur le dessus de la pioche aplatie. Effectuer le transfert de vers de la plaque d’aclimation non ensemencée à la plaque d’essai sans l’utilisation de bactéries, qui est couramment utilisé dans le transfert de vers car il contribue à coller le ver à la pioche.
         REMARQUE: La vitesse à laquelle les animaux sont transférés à cette étape est très importante parce que les premiers vers de la plaque seront exposés à l’éthanol plus longtemps que les derniers vers ajoutés à la plaque, et les points de temps plus tôt peuvent montrer des effets dépendants du temps. C’est la principale raison de la rotation des souches placées sur une plaque d’abord à travers des répliques expérimentales.
   3. Effectuer Locomotion Assay: Tournage
      1. Utilisez une combinaison microscope/caméra qui permet l’imagerie simultanée des quatre anneaux dans le champ de vision (environ 42x42 mm² carrés), comme un objectif microscope de 0,5 x, un grossissement de 0,8 x et une caméra avec un CCD de 7,4 pixels 2048x2048.
      2. Utilisez même l’éclairage à travers le champ de vision, ce qui facilite la reconnaissance des objets à l’étape du seuil d’intensité. Un rétro-éclairage de 3"x3 » fonctionne bien.
      3. Imagez les vers sur une plaque positionnée côté média vers le haut (couvercle vers le bas), ce qui génère un contraste qui est perdu lors de l’utilisation du rétro-éclairage par rapport à une source de lumière transmise au microscope traditionnel.
      4. Préparez le logiciel d’analyse d’image pour capturer des films en accéléré des vers en mouvement. Réglez le logiciel pour capturer des images à l’échelle grise 12 bits toutes les 1 seconde, comme un film de 2 min (120 images). Pour réduire la taille du fichier de sortie, tout en conservant une résolution d’image suffisante, utilisez un mode binning 2x2 pour capturer des images pixel 1024x1024.
      5. Enregistrez les films. Commencez à enregistrer un film de 120 images de la première plaque (0 mM d’éthanol) 10 min après que les derniers vers ont été placés sur cette plaque. Enregistrez le fichier de film.
      6. Enregistrez la deuxième plaque (éthanol de 400 mM). Répétez ce processus pour les deux plaques à partir de 30 min après que les derniers vers ont été placés sur la première plaque (0 mM d’éthanol) pour capturer les points de temps de 30-32 min pour chaque exposition.
         REMARQUE: Prévoyez suffisamment de temps pour enregistrer les fichiers d’image après chaque session de capture avant de commencer l’enregistrement de la plaque suivante à analyser.
      7. Pour l’épreuve future des films archivés et pour permettre à ces films d’être ouverts et analysés par d’autres logiciels d’imagerie open source du domaine public, tels que ImageJ, convertir une copie de chaque film en fichiers TIFF à échelle grise 8 bits 256.
         REMARQUE: Le logiciel d’analyse d’image décrit ici utilise un format de fichier propriétaire.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.