C. एलिगेंस आंदोलन ट्रैकिंग: कीड़े में लोकोमोशन का आकलन करने के लिए एक विधि

Overview

यह वीडियो एक क्षेत्र में कीड़ा आंदोलन रिकॉर्ड करने के लिए वीडियो और ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के उपयोग का वर्णन करता है ।  उदाहरण प्रोटोकॉल कृमि लोकोमोशन पर इथेनॉल एक्सपोजर के प्रभाव को मापता है।

Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल डेविस एट अल का एक अंश है, जो कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस, जे विस एक्सपी की लोकोमोशन स्पीड पर इथेनॉल के प्रभाव को मापने के लिए एक परख है। (2015).

1. परख से पहले दिन पर प्रदर्शन करने के लिए कदम

   1. ताजा सूत्रकृमि विकास माध्यम (एनजीएम) प्लेटों के लिए L4 चरण कीड़े उठाओ OP50 ई. कोलाईके लॉन के साथ वरीयता प्राप्त है, और उन्हें 20 डिग्री सेल्सियस O/N पर संस्कृति । प्रत्येक परख की स्थिति के लिए 10 कीड़े की आवश्यकता होती है; कीड़े के ओ/एन नुकसान के लिए अनुमति देने के लिए कीड़े की एक अतिरिक्त उठाओ ।
      1. केवल परख जानवरों कि पहले दिन वयस्क हैं; कई म्यूटेंट जंगली प्रकार की तुलना में धीमी गति से बढ़ते हैं। उन उपभेदों के लिए चुनने के समय को समायोजित करें जिनमें विकासात्मक देरी होती है ताकि सभी जानवरों का परीक्षण पहले दिन के वयस्क हों।
2. परख के दिन प्रदर्शन करने के लिए कदम
   1. परख के लिए तैयारी:
      1. मानक गैर वरीयता प्राप्त 60 x 15 मिमी एनजीएम प्लेटों पर परख करें। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग की जाने वाली सभी प्लेटों को सूखा लें, जिसमें ढक्कन बंद हो जाते हैं। प्रत्येक प्रयोगात्मक परीक्षण के लिए, चार सूखे एनजीएम प्लेटों का उपयोग करें; ये 0 mm और 400 mm इथेनॉल परख प्लेटें और उनके साथ अभिनंदन प्लेटें होंगी।
         नोट: एनजीएम प्लेटों का उपयोग यहां महत्वपूर्ण है; प्लेटों की संरचना में अंतर, विशेष रूप से उनकी ऑस्मोलारिटी, व्यवहार पर इथेनॉल की खुराक प्रतिक्रिया को दृढ़ता से प्रभावित कर सकती है, यह कम से कम भाग में, जानवरों द्वारा संचित इथेनॉल की मात्रा में परिवर्तन के कारण है। एनजीएम आगार 160 एमओएम है।
      2. सूखने के बाद, परख में उपयोग की जाने वाली प्रत्येक गैर-वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेटों का वजन करें और वजन नोट करें। एक खाली प्लेट के वजन के आधार पर प्लेटों में मीडिया की मात्रा निर्धारित करें। एगर के वजन को मात्रा में बदलने का अनुमान लगाने के लिए, मान लें कि मीडिया का वजन पानी की बराबर मात्रा के समान है।
         नोट: हमारे सबसे सुसंगत परिणाम एनजीएम मीडिया के साथ पाए गए हैं जो पर्याप्त रूप से निर्जलित हैं कि मूल 10 मिलीलीटर की मात्रा में 8.3-8.9 मिलीलीटर के बीच पोस्ट-सुखाने की मात्रा है। 2 घंटे शुष्क समय के लिए एक विकल्प के लिए सूखी जब तक प्लेटें इस मात्रा सीमा तक पहुंचने के लिए इनक्यूबेटर में अंतर के लिए खाते है ।
      3. 4 तांबे के छल्ले (1.6 सेमी के भीतरी व्यास) को प्रत्येक प्लेटों की सतह में पिघलाएं ताकि विभिन्न जीनोटाइप या कीड़े के उपचार समूहों के लिए कोरल के रूप में कार्य किया जा सके। प्रत्येक अंगूठी को संदंश के साथ पकड़ें, और एक लौ में गर्मी (बंसेन बर्नर से एक मजबूत लौ अच्छी तरह से काम करती है) लगभग 3 सेकंड के लिए। तुरंत एक थाली पर अंगूठी जगह है, जबकि अभी भी संदंश के साथ अंगूठी पकड़ इसे ' लंघन ' से रोकने के लिए ।
         1. सुनिश्चित करें कि अंगूठी अंगूठी पर कई बिंदुओं पर संदंश के साथ धीरे से दबाकर आगर की सतह के खिलाफ फ्लैट टिकी हुई है। अंगूठी रखते समय, अतिरिक्त तीन छल्ले के लिए जगह छोड़ने के लिए सावधान रहें।
         2. थाली की सतह में तीन अतिरिक्त तांबे के छल्ले पिघला, देखभाल करने के लिए उंहें एक साथ के रूप में संभव के रूप में बंद इतना है कि सभी चार कैमरे के देखने के क्षेत्र में होगा जगह ।
            नोट: परख के दौरान केड़ों को छल्ले में रखने के लिए आगर के साथ अच्छी मुहर लगाना जरूरी है। छल्ले जो प्लेट पर चारों ओर छोड़ देते हैं, आगर के साथ सही सील बनाने की संभावना नहीं है और आगर को निशान दे सकता है, जो कीड़े को बिल करने की अनुमति देता है और कीड़े की कल्पना में हस्तक्षेप करता है।
         3. प्रत्येक परख प्लेट के लिए एक साथ "अभिनंदन" प्लेट तैयार करें, जिसे सूख और अनदेखा किया जाना चाहिए और कोई इथेनॉल प्राप्त नहीं होगा। इन प्लेटों पर तांबे के चार छल्ले रखें।
      4. अंगूठी में उपयोग किए जाने वाले कीड़े तनाव के साथ प्रत्येक अंगूठी के बगल में प्लेटों के नीचे लेबल करें, अंगूठी के दृश्य के क्षेत्र में न लिखने का ध्यान रखें। परख प्लेट पर लेबल को उसके साथ अभिनंदन प्लेट से मेल खाते हैं।
      5. प्रत्येक परख प्लेट में जोड़ने के लिए 100% इथेनॉल की मात्रा की गणना करें ताकि अंतिम एकाग्रता 0 एमएमएम या 400 एमएमएल इथेनॉल (मात्रा तक वजन) हो। प्रत्येक प्रयोग(एन = 1) के लिए, एक 0 mM और एक 400 mM इथेनॉल प्लेट होगी; अभिनंदन प्लेटों को इथेनॉल प्राप्त नहीं होता है। इथेनॉल जोड़ें, इसे प्लेट की सतह के चारों ओर पाइपिंग करें। प्लेट को सील करने के लिए प्रयोगशाला फिल्म का उपयोग करें और इसे 2 घंटे के लिए बेंच टॉप पर बराबरी करने की अनुमति दें।
      6. जब 1.5 घंटा बीत चुका है, परख के अभिनंदन कदम शुरू, चरण 2.2।
   2. लोकोमोशन परख करें: परख प्लेटें
      1. प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के 10 कीड़े को अभिनंदन प्लेट पर तांबे की अंगूठी के केंद्र में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। कीड़ा लेने के साथ धीरे से खुरचन द्वारा इस बिंदु पर आगर पर दिखाई दे रहा है कि किसी भी भोजन को हटा दें। प्रायोगिक परीक्षणों में प्रायोगिक समूहों को प्लेटों पर रखने के क्रम को अलग-अलग करें ताकि परीक्षणों में एक ही क्रम में प्लेटों पर एक ही उपभेद नहीं रखा जा सके।
         नोट: लक्ष्य भोजन की न्यूनतम मात्रा के साथ थाली में जानवरों को स्थानांतरित करना है, क्योंकि यदि अभिनंदन प्लेट पर भोजन परख प्लेट में स्थानांतरित किया जाता है तो कीड़े भोजन के आसपास एकत्रित हो जाएंगे और लोकोमोशन पर दवा का प्रभाव अस्पष्ट हो जाएगा।
      2. सावधान रहें कि लेने के साथ एगर की सतह को न तोड़ें, क्योंकि यह कीड़े को बिल करने की अनुमति देगा और परख को बाधित करेगा। 30 मिनट के लिए आरटी में कीड़े इनक्यूबेट।
      3. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक प्लेट की शुरुआत के बीच एक उचित अंतराल है। एक अनुभवी प्रयोगकर्ता 40 जानवरों को स्थानांतरित कर सकता है, 10/अंगूठी में 4 छल्ले के लिए & १.५ मिनट, लेकिन 2 मिनट तक किसी भी अंतराल स्वीकार्य है । मानक परख में 0 mm और 400 mm इथेनॉल दोनों के लिए 10-12 मिनट और 30-32 मिनट के एक्सपोजर पर रिकॉर्डिंग फिल्में हैं।
      4. 0 एमएमएस एक्सपोजर के लिए अभिनंदन प्लेट शुरू करें और 400 mM एक्सपोजर के लिए अभिनंदन प्लेट लगभग 2 मिनट और 30 सेकंड के अलावा दूसरी फिल्म शुरू होने से पहले पहली फिल्म फ़ाइल की बचत के लिए अनुमति देने के लिए।
      5. 30-न्यूनतम अभिनंदन अवधि के बाद, कीड़े को अभिनंदन प्लेटों से परख प्लेटों में स्थानांतरित करें। कीड़े को परख प्लेटों (0 mm या 400 mm इथेनॉल) में उसी क्रम में स्थानांतरित करें कि उन्हें प्रत्येक प्लेट के पूर्णताओं के बीच के समय का ट्रैक रखते हुए अभिनंदन प्लेट में जोड़ा गया था। वाष्पीकरण के लिए इथेनॉल के नुकसान को कम करने के लिए प्रयोगशाला फिल्म के साथ प्लेट सील करें।
      6. चपटा लेने के शीर्ष पर कीड़े इकट्ठा करने के लिए एक पतली धार चपटा कीड़े लेने के साथ एक स्कूपिंग गति का प्रयोग करें। गैर वरीयता प्राप्त अभिनंदन प्लेट से बैक्टीरिया के उपयोग के बिना परख प्लेट में कीड़े का हस्तांतरण करें, जिसका उपयोग आमतौर पर कीड़े को स्थानांतरित करने में किया जाता है क्योंकि यह कीड़े को लेने के लिए गोंद करने में मदद करता है।
         नोट: जिस गति से जानवरों को इस कदम पर स्थानांतरित किया जाता है वह बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि प्लेट पर पहले कीड़े प्लेट में जोड़े गए अंतिम कीड़े की तुलना में इथेनॉल के संपर्क में होंगे, और पहले के समय के अंक कुछ समय पर निर्भर प्रभाव दिखा सकते हैं। यह घूर्णन का प्रमुख कारण है जो उपभेदों को प्रयोगात्मक प्रतिकृति में पहले एक प्लेट पर रखा जाता है।
   3. लोकोमोशन परख करें: फिल्मांकन
      1. एक माइक्रोस्कोप/कैमरा संयोजन का उपयोग करें जो दृश्य के क्षेत्र में सभी चार छल्ले (लगभग 42x42 मिमी² वर्ग) की एक साथ इमेजिंग की अनुमति देता है, जैसे कि 0.5x माइक्रोस्कोप उद्देश्य, 0.8x आवर्धन और 2048x2048 7.4 4 पिक्सल सीसीडी के साथ एक कैमरा।
      2. देखने के क्षेत्र में भी रोशनी का उपयोग करें, जो तीव्रता सीमा कदम पर वस्तु मांयता में एड्स । एक 3 "x3" बैकलाइट अच्छी तरह से काम करता है।
      3. एक प्लेट पर कीड़े की छवि मीडिया-साइड अप (ढक्कन नीचे), जो विपरीत उत्पन्न करता है जो पारंपरिक माइक्रोस्कोप प्रेषित प्रकाश स्रोत की तुलना में बैकलाइट का उपयोग करते समय खो जाता है।
      4. चलती कीड़े की समय-चूक फिल्मों पर कब्जा करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर तैयार करें। 2-मिनट (120 फ्रेम) फिल्म के रूप में, हर 1 सेकंड में 12-बिट ग्रे-स्केल छवियों को कैप्चर करने के लिए सॉफ्टवेयर सेट करें। आउटपुट फ़ाइल के आकार को कम करने के लिए, अभी भी पर्याप्त छवि रिज़ॉल्यूशन को बनाए रखते हुए, 1024x1024 पिक्सेल छवियों को कैप्चर करने के लिए 2x2 बिनिंग मोड का उपयोग करें।
      5. फिल्मों को रिकॉर्ड करें। उस प्लेट पर अंतिम कीड़े रखे जाने के बाद पहली प्लेट (0 mm इथेनॉल) 10 मिनट की 120-फ्रेम फिल्म रिकॉर्ड करना शुरू करें। फिल्म फ़ाइल को बचाओ।
      6. दूसरी प्लेट (400 mm इथेनॉल) रिकॉर्ड करें। प्रत्येक एक्सपोजर के लिए 30-32 मिनट के समय अंकों को कैप्चर करने के लिए अंतिम प्लेट (0 mm इथेनॉल) पर रखे जाने के बाद 30 मिनट की शुरुआत करने वाली दोनों प्लेटों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
         नोट: अगले प्लेट की रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले प्रत्येक कैप्चर सत्र के बाद छवि फ़ाइलों को सहेजने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दें।
      7. संग्रहीत फिल्मों के भविष्य-प्रूफिंग के लिए और इन फिल्मों को अन्य सार्वजनिक डोमेन ओपन सोर्स इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम द्वारा खोला और विश्लेषण करने की अनुमति देने के लिए, जैसे इमेजजे, प्रत्येक फिल्म की एक प्रति को 8-बिट 256 ग्रे स्केल झगड़ा फ़ाइलों में परिवर्तित करें।
         नोट: यहां वर्णित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर एक मालिकाना फ़ाइल प्रारूप का उपयोग करता है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.