Overview
يقدم هذا الفيديو المفاهيم الكامنة وراء تصوير الكالسيوم ويتضمن بروتوكولا نموذجيا لتصوير الديدان الموجودة في آبار الآغاروز المصبوبة.
Protocol
هذا البروتوكول هو مقتطف من Turek وآخرون ، Agarose Microchambers لتصوير الكالسيوم على المدى الطويل من Elegans Caenorhabditis، J. Vis. Exp. (2015).
1. تصوير الكالسيوم
- استخدام السلالات المعدلة وراثيا التعبير عن أجهزة استشعار الكالسيوم المشفرة وراثيا مثل HBR16 (goeIs5 [pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR، unc-119(+)]).
- استخدام المجهر المركب مجهزة ل epifluorescence واسعة المجال. قم بتوصيل مخرج TTL لكاميرا EMCCD بإدخال TTL لل LED ، بحيث في كل مرة تسجل الكاميرا إطارا ، سيتم إضاءة العينة. استخدام وقت التعرض لحوالي 5 msec. استخدام م كسب في نطاق 50-300.
- حدد فيلم انفجار يعمل لمدة 24 ساعة مع كل دودة يتم تصويرها كل 15 - 30 دقيقة أولا لمدة 20 ثانية مع DIC ، ثم لمدة 20 ثانية مع مضان GFP لتسجيل GCaMP ، ومن ثم التقاط صورة نهائية لإشارة mKate2 للتحكم في مستويات التعبير. استخدم معدل إطار 2/ثانية أثناء كل انفجار.
- لفحص البيانات المرئية، استخدم خريطة زائفة اللون لتعزيز رؤية التغيرات الصغيرة في كثافة الفلورسينس. رسم بيانات الفلورسنت ك ΔF/F، مع F هو متوسط القيمة الأساسية للفلورسينس. يمكن العثور على وصف مفصل لتحليل بيانات الكالسيوم في الأدبيات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning |
