Overview
このビデオでは、カルシウムイメージングの背後にある概念を紹介し、成形アガロースウェルに含まれるワームのタイムラプスイメージングのプロトコルの例を紹介します。
Protocol
このプロトコルは、テレクら、カエノハブディティスエレガンスの長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー 、J.Vis.Expからの抜粋です。(2015).
1. カルシウムイメージング
- HBR16などの遺伝子組み換えカルシウムセンサーを発現するトランスジェニック株を使用する (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2:::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]
- 広視野の蛍光を得るための複合顕微鏡を使用してください。EMCCDカメラのTTL出力をLEDのTTL入力に接続して、カメラがフレームを記録するたびにサンプルが点灯するようにします。約5ミリ秒の露光時間を使用してください。50から300の範囲でEMゲインを使用してください。
- 各ワームがDICで20秒間最初に15〜30分ごとに画像化され、次にGFP蛍光で20秒間GCaMPを記録し、mKate2信号の最終画像を取って発現レベルを制御するために撮影された状態で、24時間実行するバーストムービーを指定します。各バーストの間に 2/秒のフレーム レートを使用します。
- 目視データ検査では、蛍光強度の小さな変化の可視性を高めるために偽色マップを使用します。蛍光データをΔF/Fとしてプロットし、Fは蛍光の平均ベースライン値とする。カルシウムデータ分析の詳細な説明は、文献で見つけることができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning |
