UV-bestraling: een methode om extrachromosomale arrays te integreren

Overview

Micro-invoeging van transgenes resulteert meestal in C. elegans stammen met grote extrachromosomale arrays, wat resulteert in variabele expressie en transmissie van het transgene.  UV-bestraling kan chromosomale integratie van de array en stabielere transgene transmissie induceren.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Mariol et al, A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate in the C. elegans Genome, J. Vis. Exp. (2013).

1. UV-bestraling en herstel van transgene wormen

1. Wormbestraling:
   1. Pluk 30-100 fluorescerende transgene L4-dieren op afzonderlijke kweekplaten (15-20 dieren per plaat).
   2. Plaats de platen, met de deksels verwijderd, in een UV-kruis-linker. Bestraal de wormen op 0,012 J/cm². Merk op dat stammen min of meer gevoelig zijn voor UV en dat de resultaten variabel kunnen zijn, afhankelijk van de gebruikte UV-bestralingsmachine. Een dosisbereik tussen 0,010-0,015 J/cm² kan worden getest.
2. Wormherstel na bestraling:
   1. Plaats platen met bestraalde wormen 's nachts bij 15 °C voor herstel.
   2. Controleer op het aantal dieren dat leeft. In onze handen wordt een overlevingskans van ongeveer 80-90% aangepast voor een efficiënte bestraling.
   3. Laat de bestraalde dieren groeien bij 15-25 °C totdat het nageslacht de ontwikkelingsfase heeft bereikt, waardoor de muntmarkeringsuitdrukking kan worden waargenomen.

2. Isolatie van geïntegreerde transgene lijnen

1. Selectie van F1-dieren:
   1. Enkele 150-200 fluorescerende F1-dieren op afzonderlijke kweekplaten. Voor sterk overbrengende lijnen (≥80%) zijn 100 F1-dieren voldoende.
   2. Houd deze F1-platen op 15-25 °C totdat het nageslacht een geschikt stadium bereikt voor de observatie van fluorescerende F2-dieren.
   3. Gooi alle F1-platen met i) geen nakomelingen weg, wat aangeeft dat het F1-dier steriel was of stierf, of ii) geen of slechts enkele fluorescerende F2-dieren, wat aangeeft dat het F1-dier het transgene niet met de verwachte snelheid heeft overgedragen. Deze stap is snel en vertegenwoordigt een echt voordeel in vergelijking met het standaardprotocol dat een schatting vereist van het percentage fluorescerende F2-wormen om F1-platen te selecteren die ≥75% fluorescerend nageslacht vertonen (Tabel 1).
2. Selectie van F2-dieren:
   1. Enkele vier fluorescerende transgene F2-dieren van elke geselecteerde F1-plaat. Kies bij het gebruik van fluorescerende transgenen (bijvoorbeeld mCherry, gfp of dsRed) F2-wormen met een hoge mate van fluorescentie, omdat dit erop kan wijzen dat deze dieren homozygoot zijn voor de geïntegreerde array. Merk op dat het bij het plukken van F2-dieren van cruciaal belang is om geen eieren of larven mee te nemen, om valse negatieven in de volgende stap te voorkomen.
   2. Kweek F2-dieren bij 15-25 °C.
3. Isolatie en validatie van geïntegreerde transgene stammen:
   1. Scherm F2 platen voor 100% fluorescerende transgene F3 wormen. Het scherm is vrij snel omdat de aanwezigheid van een enkele niet-fluorescerende worm aangeeft dat de plaat moet worden weggegooid. Een F2 dierlijke homozygoot voor het geïntegreerde transgeen geeft 100% homozygoot fluorescerend nageslacht.
   2. Enkele acht fluorescerende F3-dieren van geselecteerde platen om de 100% overerving van het transgeen te bevestigen. In theorie is het kiezen van één dier voldoende bij deze stap. Het kiezen van acht fluorescerende F3-dieren kan echter nodig zijn om te voorkomen dat onvruchtbare of ongezonde dieren worden geselecteerd, omdat bestraling willekeurig mutaties kan veroorzaken die genen beïnvloeden die belangrijk zijn voor wormfysiologie.
   3. Houd indien mogelijk verschillende onafhankelijke geïntegreerde transgene stammen, d.w.z. stammen die zijn teruggewonnen van verschillende F1-dieren.

Representative Results

Tabel 1. Vergelijking van de standaard en verbeterde protocollen voor extrachromosomale arrays integratie in het C. elegans genoom. Twee niet-geïntegreerde transgenes die met ongeveer dezelfde frequentie zenden, werden geïntegreerd met behulp van de standaard of het verbeterde protocol. Het belangrijkste verschil ligt in het feit dat in het standaardprotocol een scherm van het nageslacht op alle F1-platen wordt uitgevoerd om het percentage transgene F2-wormen te schatten, dat moet worden ≥ 75%. Deze stap duurt lang, vooral als de initiële transmissiesnelheid bijna 75% bedraagt. In het verbeterde protocol is het voldoende om vier F2-wormen van elke F1-plaat met transgene F2-dieren te onderscheiden en te screenen op 100% transgene wormen in het nageslacht (F3), die snel kunnen worden uitgevoerd. Het standaardprotocol is aangepast.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms