UV-Bestrahlung: Eine Methode zur Integration extrachromosomaler Arrays

Overview

Die Mikroinjektion von Transgenen führt in der Regel zu C. elegans-Stämmen mit großen extrachromosomalen Arrays, die zu variabler Expression und Transmission des Transgens führen.  UV-Bestrahlung kann eine chromosomale Integration des Arrays und eine stabilere Transgenübertragung induzieren.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Mariol et al, A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome, J. Vis. Exp. (2013).

1. UV-Bestrahlung und Rückgewinnung von transgenen Würmern

1. Wurmbestrahlung:
   1. Wählen Sie 30-100 fluoreszierende transgene L4-Tiere auf separate Kulturplatten (15-20 Tiere durch Platte).
   2. Legen Sie die Platten mit entfernten Deckeln in einen UV-Verkreuzer. Bestrahlen Sie die Würmer bei 0,012 J/cm². Beachten Sie, dass Stämme mehr oder weniger empfindlich gegen UV sind und dass die Ergebnisse je nach verwendetem UV-Bestrahlungskörper variabel sein können. Es kann ein Dosisbereich zwischen 0,010-0,015 J/cm² getestet werden.
2. Wurmrückgewinnung nach Bestrahlung:
   1. Platten mit bestrahlten Würmern über Nacht bei 15 °C zur Erholung aufstellen.
   2. Überprüfen Sie, ob die Anzahl der Tiere, die noch am Leben sind, erhalten ist. In unseren Händen wird eine Überlebensrate von ca. 80-90% für eine effiziente Bestrahlung angepasst.
   3. Wachsen Sie die bestrahlten Tiere bei 15-25 °C, bis die Nachkommenschaft das Entwicklungsstadium erreicht hat, das die Beobachtung der Co-Injektionsmarker-Expression ermöglicht.

2. Isolierung integrierter transgener Linien

1. Auswahl der F1-Tiere:
   1. Einzelne 150-200 fluoreszierende F1-Tiere auf separaten Kulturplatten. Für hochsende Leitungen (≥80%) reichen 100 F1-Tiere aus.
   2. Bewahren Sie diese F1-Platten bei 15-25 °C auf, bis die Nachkommenschaft ein geeignetes Stadium für die Beobachtung fluoreszierender F2-Tiere erreicht.
   3. Entsorgen Sie alle F1-Platten, die entweder i) keine Nachkommen aufweisen, was darauf hindeutet, dass das F1-Tier steril war oder verendete, oder ii) keine oder nur wenige fluoreszierende F2-Tiere, was darauf hindeutet, dass das F1-Tier das Transgen nicht mit der erwarteten Geschwindigkeit übertragen hat. Dieser Schritt ist schnell und stellt einen echten Vorteil im Vergleich zum Standardprotokoll dar, das eine Schätzung des Prozentsatzes fluoreszierender F2-Würmer erfordert, um F1-Platten auszuwählen, die ≥75% fluoreszierende Nachkommen aufweisen (Tabelle 1).
2. Auswahl der F2-Tiere:
   1. Einzelne vier fluoreszierende transgene F2-Tiere aus jeder ausgewählten F1-Platte. Bei verwendung von fluoreszierenden Transgenen (z. B. mCherry, gfp oder dsRed) sollten F2-Würmer mit einem hohen Fluoreszenzgehalt ausgewählt werden, da dies darauf hindeuten könnte, dass diese Tiere für das integrierte Array homozygot sind. Beachten Sie, dass es bei der Kommissionierung von F2-Tieren wichtig ist, keine Eier oder Larven mit sich zu führen, um im nächsten Schritt falsche Negative zu vermeiden.
   2. F2-Tiere bei 15-25 °C anbauen.
3. Isolierung und Validierung integrierter transgener Stämme:
   1. Sieb-F2-Platten für 100% fluoreszierende transgene F3-Würmer. Der Bildschirm ist ziemlich schnell, da das Vorhandensein eines einzelnen nicht fluoreszierenden Wurms darauf hinweist, dass die Platte weggeworfen werden sollte. Ein F2-Tier homozygot für das integrierte Transgen wird 100% homozygote fluoreszierende Nachkommenschaft geben.
   2. Einzelne acht fluoreszierende F3-Tiere aus ausgewählten Platten, um die 100%ige Vererbung des Transgens zu bestätigen. Theoretisch reicht es aus, ein Tier zu pflücken. Die Entnahme von acht fluoreszierenden F3-Tieren kann jedoch notwendig sein, um die Auswahl unfruchtbarer oder ungesünder Tiere zu vermeiden, da die Bestrahlung zufällig Mutationen induzieren kann, die Gene betreffen, die für die Wurmphysiologie wichtig sind.
   3. Halten Sie nach Möglichkeit mehrere unabhängige integrierte transgene Stämme, d. h. Stämme, die von verschiedenen F1-Tieren zurückgewonnen wurden.

Representative Results

Tabelle 1. Vergleich der Standard- und verbesserten Protokolle für die Integration extrachromosomaler Arrays in dasGenom vonC. elegans. Zwei nicht integrierte Transgene, die mit ungefähr der gleichen Frequenz übertragen, wurden mit dem Standard oder dem verbesserten Protokoll integriert. Der Hauptunterschied besteht darin, dass im Standardprotokoll ein Bildschirm der Nachkommenschaft auf allen F1-Platten durchgeführt wird, um den Prozentsatz der transgenen F2-Würmer zu schätzen, der ≥ 75% betragen sollte. Dieser Schritt dauert lange, insbesondere wenn die anfängliche Übertragungsrate nahe 75 % liegt. Im verbesserten Protokoll reicht es aus, vier F2-Würmer von jeder F1-Platte mit transgenen F2-Tieren zu erfassen und 100% der transgenen Würmer in der Nachkommenschaft (F3) zu überprüfen, die schnell durchgeführt werden können. Das Standardprotokoll wird angepasst.  

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms