UV Işınlama: Ekstrakrozomal Dizileri Entegre Etme Yöntemi

Overview

Transjenlerin mikroenjeksiyonu genellikle büyük ekstrakrozomal dizilere sahip C. elegans suşlarına neden olur ve bu da transjenin değişken ekspresyasyonu ve iletimi ile sonuçlanır.  UV Işınlama, dizinin kromozomal entegrasyonuna ve daha kararlı transgene iletimine neden olabilir.

Protocol

Bu protokol Mariol ve ark.'danbir alıntıdır,Yüksek İletim Hızına Sahip Ekstrakromosomal Dizileri C. elegans Genomuna Entegre Etmek için Hızlı Bir Protokol, J. Vis. Exp. (2013). 

1. Transgenik Solucanların UV Işınlanması ve Geri Kazanımı

1. Solucan ışınlama:
   1. Ayrı kültür plakalarına (plakaya göre 15-20 hayvan) 30-100 floresan transgenik L4 hayvanı seçin.
   2. Kapakları çıkarılmış plakaları bir UV çapraz bağlayıcıya yerleştirin. Solucanları 0.012 J/cm 2'deışınla. Suşların UV'ye karşı az çok hassas olduğunu ve kullanılan UV ışınlayıcısına bağlı olarak sonuçların değişken olabileceğini unutmayın. 0.010-0.015 J/cm² arasında bir doz aralığı test edilebilir.
2. Işınım sonrası solucan kurtarma:
   1. Işınlanmış solucanlara sahip plakaları iyileşme için gece boyunca 15 °C'ye yerleştirin.
   2. Hayatta olan hayvanların sayısını kontrol edin. Elimizde, yaklaşık% 80-90'lık bir hayatta kalma oranı verimli bir ışınlama için uyarlanır.
   3. Radyasyona maruz kalan hayvanları 15-25 ° C'de yetiştirin, soy, sikke işaretleyici ifadesinin gözlemlenmesine izin vererek gelişim aşamasına ulaşana kadar yetiştirin.

2. Entegre Transgenik Hatların İzolasyonu

1. F1 hayvanlarının seçimi:
   1. Ayrı kültür plakalarına tek 150-200 floresan F1 hayvanı. Yüksek iletim hatları için (%≥80), 100 F1 hayvanı yeterlidir.
   2. Bu F1 plakalarını, soy floresan F2 hayvanlarının gözlemlenmesi için uygun bir aşamaya ulaşana kadar 15-25 ° C'de tutun.
   3. I) F1 hayvanının kısır veya öldüğünü gösteren hiçbir soy veya ii) F1 hayvanının transjeni beklenen hızda iletmediğini gösteren, floresan F2 hayvanı olmadığını veya sadece birkaç floresan F2 hayvanı olmadığını gösteren tüm F1 plakalarını atın. Bu adım hızlıdır ve floresan F2 solucanlarının yüzdesinin tahminini gerektiren standart protokolle karşılaştırıldığında gerçek bir avantajı temsil eder ≥75% floresan soyu sergileyen F1 plakalarını seçmek için (Tablo 1).
2. F2 hayvanlarının seçimi:
   1. Seçilen her F1 plakasından tek dört floresan transgenik F2 hayvanı. Floresan transgenes kullanırken (örneğin mCherry, gfp veya dsRed), bu hayvanların entegre dizi için homozigous olduğunu gösterebileceğinden, yüksek floresan seviyesine sahip F2 solucanlarını seçin. F2 hayvanlarını toplarken, bir sonraki adımda yanlış negatifleri önlemek için yumurta veya larva taşımamanın kritik olduğunu unutmayın.
   2. F2 hayvanlarını 15-25 ° C'de yetiştirin.
3. Entegre transgenik suşların izolasyonu ve doğrulanması:
   1. %100 floresan transgenik F3 solucanları için ekran F2 plakaları. Tek bir buharsız solucanın varlığı plakanın atılması gerektiğini gösterdiğinden ekran oldukça hızlıdır. Entegre transgene için homozigous bir F2 hayvan% 100 homozigöz floresan soy verecektir.
   2. Transjenin% 100 mirasını doğrulamak için seçilen plakalardan tek sekiz floresan F3 hayvanı. Teoride, bu adımda bir hayvan seçmek yeterlidir. Bununla birlikte, ışınlama solucan fizyolojisi için önemli genleri etkileyen mutasyonlara rastgele neden olabileceğinden, sekiz floresan F3 hayvanı seçmek, döllenmemiş veya sağlıksız hayvanların seçilmesini önlemek için gerekli olabilir.
   3. Mümkünse birkaç bağımsız entegre transgenik suş, yani farklı F1 hayvanlarından elde edilen suşları saklayın.

Representative Results

Tablo 1. C. elegans genomuna ekstrakrozomal dizi entegrasyonu için standart ve geliştirilmiş protokollerin karşılaştırılması. Yaklaşık aynı frekansta iletilen iki nonintegrated transgenes standart veya geliştirilmiş protokol kullanılarak entegre edildi. Temel fark, standart protokolde, tüm F1 plakalarındaki soyun bir ekranının, % 75'≥ olması gereken transgenik F2 solucanlarının yüzdesini tahmin etmek için yapılması gerçeğinde yatmaktadır. Bu adım, özellikle ilk iletim oranı% 75'e yakınsa uzun zaman alır. Geliştirilmiş protokolde, transgenik F2 hayvanlarını taşıyan her F1 plakasından dört F2 solucanının tekli olması ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilen soydaki (F3) transgenik solucanların% 100'ünü taramak yeterlidir. Standart protokol uyarlanmıştır.  

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms