마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서 Published: June 1, 2010 doi: 10.3791/2017

DOI

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Craig T. Lefort¹, Minsoo Kim¹

¹Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

Summary

T 림프구 마이 그 레이션 림프 기관, vasculature에서 출구로 유도하는 동안 발생하고, 주변 조직을 체결. 여기, 우리는 T 림프구 마이 그 레이션을 분석하는 데 사용할 수있는 프로토콜을 설명

Abstract

T lymphocytes의 마이 그 레이션은 다른 세포 또는 세포외 기질 단백질로 표현 리간드와 함께 세포 표면 integrins의 접착제 상호 작용을 포함한다. 낮은 친화 상태에서 세포 첨단에 높은 친화력 상태로 integrins의 정확한 spatiotemporal 활성화 T 림프구 마이 그 레이션에 대한 중요

Protocol

1. 인간의 T Lymphocytes의 분리

1. 건강한 기증자로부터 인간의 혈액을 구합니다. 혈액은 다음 단계로 진행하기 전에 실내 온도 (~ 30 분)로 냉각 수 있습니다.
2. 부드럽게 8 ML 왕복 하단의 폴리스티렌 튜브로 실내 온도 Polymorph 밀도 기울기 미디어 3 ML을 피펫. 부드럽게 Polymorph 미디어 위에 전체 혈액의 3 ML를 추가합니다. 두 시약의 혼합되지 않도록하는 것이 중요합니다.
3. 실온에서 45 분간 500 XG에서 튜브를 원심 분리기.
4. 원심 분리에 따라, 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)는 이제 최고 셀 레이어에 다른 혈액 구성 요소에서 분리합니다. PBMC 계층은 첫 번째 흐림 밴드로, 위에서 아래로 나타납니다.
5. 조심스럽게 PBMC 레이어 위에 혈액의 맑은 노란색 상위 단계를 제거하고 15 ML 50 ML 원뿔 관에 PBMC 레이어를 전송하는 P1000 micropipette를 사용합니다.
6. 오분 때마다 500 XG에서 세포를 centrifuging, PBS로 두 번 PBMC 씻으십시오. 뜨는은 각 씻고 나서 약간 뿌연됩니다.

2. 인간의 T Lymphocytes의 문화

1. 피펫 사용하여 10 % FBS를 포함한 20 ML RPMI 1640 미디어 T - 75 문화 플라스크에 PBMC을 전송, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 μg / ML phytohemagglutinin (PHA).
2. 37 품어 ° C와 5% 적어도 1 시간 및 최대 24 시간 동안 CO _2. 이 단계는 중단에 남아 lymphocytes에서 분리된 것으로, 술병의 표면에 점착 성의 것입니다 monocytes을 수 있습니다. 짧은 부화 (1 시간)가이 단계에서 사용하는 경우, 그것은 단계 2.1에 명시된 바와 같이 PHA와 보완없이 10% FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는 RPMI 1640 미디어를 사용하기 위해 허용됩니다.
3. 신중하게, 술병에서 미디어를 모두 제거 50 ML 원뿔 관에 추가하고, 5 분 500 XG에 원심 분리기.
4. 지금은 주로 lymphocytes을 포함하는 세포 펠렛을 Resuspend, 10 % FBS를 포함한 25 ML RPMI 1640 미디어를 포함하는 새로운 T - 75 플라스크에 세포를 전송, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 μg / ML PHA.
5. 삼일 (PBMC의 초기 부화가 야간 있었다면 이일)에 대한 37 ° C에서 알을 품다. 성장 후 24 시간 후, 신선한 미디어 15-20 ML을 추가하고 큰 T - 175 플라스크로 전송해야 할 수도 있습니다.
6. 삼일 후, 50 ML 원뿔 관에 술병과 전송에서 미디어 및 정지 lymphocytes를 제​​거하는 피펫을 사용합니다. 5 분 500 XG에 원심 분리기.
7. 10% FBS 25 ML (T - 75) 50 ML (T - 175) RPMI 1640을 포함하는 새로운 T - 75 또는 T - 175 플라스크에 세포 펠릿 및 전송 세포를 Resuspend, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 20 NG / ML 인간 IL - 2 또는 IL - 15.
8. 4-7일에 대한 lymphocytes 성장. T - 75 플라스크로 시작하는 경우, 문화 1-2 일 후에 확대와 T - 175 플라스크로 전송해야합니다.

3. 관내 림프구 마이 그 레이션 분석에서

1. 마이 그 레이션 분석하기 전에 일일, 코트 4 PBS에서 A 또는 G 하루 20 μg / ML 단백질과 유리 바닥 0.17 mm 요리 ° C.
2. PBS로 광범위하게 접시를 씻으십시오.
3. 인간 ICAM-1/Fc (10 μg / ML)과 인간 SDF - 1 접시에 PBS 용액에서 이러한 시약을 추가하고 실온에서 4 시간 잠복기 (2 μg / ML).를 무력화
4. 먼저 hemacytometer를 사용하여 T - 175 플라스크에 문화의 세포 밀도를 결정하여 T lymphocytes를 준비합니다. 약 2-5 X 10 ⁵ 세포는 마이 그 레이션 분석을 위해 적절한 세포 밀도를 달성하기 위해 요리마다 사용해야합니다.
5. PBS로 두 번 T lymphocytes 씻으 다음 1 MG / ML D - 포도당을 포함하는 하나 ML L - 15 미디어 resuspend.
6. 광범위하게 PBS로 ICAM-1/Fc와 SDF - 1 코팅 접시를 씻으십시오.
7. 접시 1 ML 미디어에서 T의 lymphocytes을 전송하고 37 그들을 유지 ° C.

4. NIS 요소 소프트웨어를 사용하여 이미지 시퀀스를 캡처

1. NIS 요소 소프트웨어를 여십시오.
2. 카메라 설정 메뉴에서, 살아있는 영상 및 이미지 캡처 모두 모드로 "2x2 비닝"을 선택합니다.
3. 응용 프로그램 메뉴로 가서 실행 / 정의 실험을 선택합니다.
4. 이미지와 이미지 캡처 시퀀스의 총 길이 사이의 시간의 길이를 선택합니다.
5. 이미지 수집을 시작하기 위해 "실행"버튼을 누르십시오.
6. 전지 추적할 수 및 마이 그 레이션 매개 변수 (속도, 경로 길이, 변위 등) ImageJ, AutoQuant 또는 Volocity (그림 1)를 포함한 여러 소프트웨어 패키지 중 하나를 사용하여 계량.
7. 각각의 셀 및 timepoint 수집 (그림 2)와 원점에서 각 셀에 대해 일반적인 시작 지점 (그림 3)과 그래프에 예상이됩니다 생성하려면 "거미줄 계획을,"XY 좌표.

5. 대표 결과

IL - 2 또는 IL - 15, T의 lymphocytes 중 하나의 존재에 문화의 일 6뿐만 아니라 긍정적인 CD4 및 / 또는 CD8 얼룩 같은 긍정적인 인 경우에는 3 번 CD의 얼룩에 의해 결정 세포의> 98%을 구성합니다. IL - 2에 대해서는 83 % CD4 + 세포가 15 % CD8 +와 <1 %의 CD4 + CD8 + 세포를 발견했습니다. IL - 15의 경우, 우리는 88 %의 CD4 + 세포, CD8 + 11% 및 <1 %의 CD4 + CD8 + 세포를 발견했습니다. ICAM-1/SDF-1 기판에 대한 T 림프구 마이 그 레이션하는 동안, 세포는 1 시간 기간 동안 유지할 수 약 15 μm의 / 분 속도를 전시. ICAM-1/SDF-1에 대한 T 림프구 마이 그 레이션, LFA - 1 - 중재 접착에 따라 달라집니다 같은 반 LFA - 1 리간드 차단 항체 것은 심각하게 마이 그 레이션을 억제.

그림 1. T lymphocytes 마이 그 레이션의 세포 추적. 전체 혈액에서 분리된 6 일간 IL - 2 또는 IL - 15의 면전에서 교양 T의 lymphocytes 10 μg / ML ICAM - 1과 함께 코팅 유리 바닥으로 요리를 준수하고 마이 그 레이션하는 허용되었습니다 2 μg / ML SDF - 1. 이미지는 30 분 10 초마다을 인수했다. 세포는 각 이미지를 식별하고 Volocity 소프트웨어를 사용하여 시간이 지남에 추적되었다. 이 영화는 ~ 15 μm의 / 분 속도로 T lymphocytes의 임의의 마이 그 레이션을 보여줍니다.

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T lymphocytes 마이 그 레이션의 영화 1. 세포 추적. T의 lymphocytes는 전체 혈액에서 분리의 면전에서 교양 IL - 2 6 일 또는 IL - 15는 10 μg / ML ICAM - 1, 2 μg / ML SDF - 1 코팅 유리 바닥으로 요리를 준수하고 마이 그 레이션하는 허용되었습니다 . 이미지는 30 분 10 초마다을 인수했다. 세포는 각 이미지를 식별하고 Volocity 소프트웨어를 사용하여 시간이 지남에 추적되었다. 이 영화는 ~ 15 μm의 / 분 속도로 T lymphocytes의 임의의 마이 그 레이션을 보여줍니다.

그림 2. Spatiotemporal 세포 위치. 각 세포의 XY 좌표는 Volocity 소프트웨어를 사용하여 각 시점에 대한 취득했다.

그림 3. "스파이더 웹 플롯." XYt를 사용하면 각 셀에 대한 15 세포가 무작위로 선택되었으며 원점에서 일반적인 출발점와 제휴해서 역모를 조정합니다. 거미 웹 음모를 비교하면 서로 다른 실험 조건 사이의 마이 그 레이션의 차이를 빠르게 시각적으로 묘사를 제공합니다. 제어 조건 하에서 T 림프구 마이 그 레이션 (왼쪽 패널) 및 안티 LFA - 1 리간드 차단 항체 (오른쪽 패널)의 존재에 플롯.

Discussion

본 실험에서는, 우리는 기본 인간 T의 lymphocytes의 운동성를 분석하는 간단한 시스템에 대한 자세한 내용을 제공합니다. 체외 마이 그 레이션 assays 다양한 세포 유형의 운동에 관련된 다양한 분자와 신호 경로의 역할을 해부하다하는 데 사용되었습니다. 우리 프로토콜에서 자신의 실험을 설계할 때 염두에 두어야하는 몇 가지 중요한 컨트롤은 다음과 같습니다 : 1) 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 폴리 - L 라이신 (PLL)과 같은 비 접착제 또는 비 인테 접착제 기판 코팅을, 각각 2 ) 인테 특정 등 SDF - 1의 프로토콜에서 설명한대로 stimulatory 신호 않고 인테 그린의 특이성, 그리고 3) 공동 코팅을 결정하는 항체 치료를 차단.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
FBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH300070.03
Penicillin-Streptomycin	GIBCO, by Life Technologies	15140
1-Step Polymorphs	Accurate Chemical & Scientific Corporation	AN221725
PHA	Remel, Thermo Fisher Scientific	R30852801
Rec. human IL-2	R&D Systems	202-IL
Rec. human IL-15	R&D Systems	247-IL
Protein G	Sigma-Aldrich	19459
Rec. human ICAM-1/Fc	R&D Systems	720-IC
Rec. human SDF-1	R&D Systems	350-NS