In Vivo Elettroporazione: un metodo site-specific per trasfetto Zebrafish

Overview

Questo video descrive l'elettroporazione in vivo, che è una tecnica per la consegna del DNA nelle cellule ependimogliali nei pesci zebra adulti.

Protocol

1. Elettroporazione

1. Rimuovere il pesce dall'installazione dell'iniezione tenendolo ancora nella spugna.
2. Immergere il lato interno della punta degli elettrodi nel gel ad ultrasuoni.
3. Coprire il telencefalo di pesce con una piccola quantità di gel ad ultrasuoni.
4. Posizionare la testa del pesce tra gli elettrodi, posizionando l'elettrodo positivo sul lato ventrale della testa del pesce e l'elettrodo negativo sul lato dorsale (Figura 1C), pur tenendo il corpo del pesce nella spugna. Questo imposta la direzione del flusso della corrente necessaria per elettroporare l'ependimoglia posizionata nella zona subventricolare.
5. Premere gli elettrodi in modo delicato e preciso contro il telencefalo(figura 1 C). Somministrare la corrente con il pedale. Tenere gli elettrodi in posizione fino al termine di tutti e cinque gli impulsi.

Representative Results

Figura 1: Rappresentazione schematica della sezione coronale del telencefalo zebrafish eluso. (A) Schema di una sezione coronale di telencefalo di zebrafish, che evidenzia la posizione delle cellule ependimogliali, che rivestono la superficie ventricolare e costruino la parete ventricolare ventrale. Lo strato ependimale dorsale sta colmando i due emisferi e copre il ventricolo (V), situato tra due strati cellulari: ependimogliale ed ependimale. (B) A sinistra, una fotografia della testa di zebrafish presa dall'alto, che evidenzia la posizione del telencefalo con una linea tratteggiata bianca. Un capillare in vetro è raffigurato in rosso, insieme al sito di destinazione per l'inserimento capillare. Nella foto a destra c'è uno schema del cervello di zebrafish che mostra la posizione dell'iniezione di plasmide in rosso. Va notato che il capillare di vetro non tocca il telencefalo e che il plasmide viene iniettato appena sopra il telencefalo nel ventricolo. T = telencefalo, OT = tectum ottico. (C) Raffigurata a sinistra è una fotografia della testa di zebrafish (vista laterale), e a destra c'è una rappresentazione della testa (vista laterale) che mostra la posizione degli elettrodi per colpire il telencefalo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultrasound gel	SignaGel, Parker laboratories INC	15-60	Electrode Gel
BTX Tweezertrodes Electrodes	Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus	45-0486	1mm diameter
Electroporation device	BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus	45-0662