In Vivo Eletroporação: Um método específico do local para transfetar zebrafish

Overview

Este vídeo descreve a eletroporação in vivo, que é uma técnica para a entrega de DNA em células ependymoglial em zebrafish adulto.

Protocol

1. Eletroporação

1. Remova o peixe da configuração da injeção enquanto ainda o segura na esponja.
2. Mergulhe o lado interno da ponta dos eletrodos no gel de ultrassom.
3. Cubra o telencephalon de peixe com uma pequena quantidade de gel de ultrassom.
4. Posicione a cabeça do peixe entre os eletrodos, colocando o eletrodo positivo no lado ventral da cabeça do peixe e o eletrodo negativo no lado dorsal(Figura 1C),enquanto ainda segura o corpo do peixe na esponja. Isso define a direção do fluxo da corrente necessária para eletroporar ependymoglia posicionada na zona subventricular.
5. Pressione os eletrodos suavemente e precisamente contra o telencephalon(Figura 1 C). Administre a corrente com o pedal do pé. Mantenha os eletrodos no lugar até que todos os cinco pulsos estejam terminados.

Representative Results

Figura 1: Representação esquemática da seção coronal do telencephalon de zebrafish. (A) Esquema de uma seção coronal de telencephalon de zebrafish, destacando a posição das células ependymoglial, que estão forrando a superfície ventricular e construindo a parede ventricular ventral. A camada ependímal dorsal está fazendo a ponte entre os dois hemisférios e cobrindo o ventrículo (V), localizado entre duas camadas celulares: ependymoglial e ependímal. (B) À esquerda, uma fotografia da cabeça de zebrafish tirada de cima, destacando a posição do telencephalon com uma linha branca tracejada. Um capilar de vidro é retratado em vermelho, juntamente com o local alvo para inserção capilar. Na foto à direita está um esquema de cérebro de zebrafish mostrando a posição da injeção plasmida em vermelho. Deve-se notar que o capilar de vidro não toca no telencephalon e que o plasmídeo é injetado logo acima do telencephalon no ventrículo. T = teleencefalon, OT = tectum óptico. (C) Retratado à esquerda é uma fotografia da cabeça de zebrafish (visão lateral), e à direita está uma representação da cabeça (visão lateral) mostrando a posição dos eletrodos a fim de atingir o telencephalon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultrasound gel	SignaGel, Parker laboratories INC	15-60	Electrode Gel
BTX Tweezertrodes Electrodes	Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus	45-0486	1mm diameter
Electroporation device	BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus	45-0662