Overview
यह वीडियो इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन का उपयोग करके वयस्क जेब्राफिश के दिल में यौगिकों को पहुंचाने की तकनीक का वर्णन करता है।
Protocol
1. इंट्राथोरेसिक इंजेक्शन के लिए मछली की तैयारी
- एक वयस्क जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)को नेट के साथ पकड़ें और इसे एनेस्थेटिक समाधान में स्थानांतरित करें।
- 1−2 मिनट के बाद, जब मछली तैराकी बंद कर देती है और ऑपरकुलम का आंदोलन कम हो जाता है, तो मछली को प्लास्टिक के चम्मच से स्पर्श करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह किसी भी संपर्क पर प्रतिक्रिया नहीं करता है।
- जल्दी और ध्यान से गीले स्पंज के नाली में चम्मच के साथ मछली स्थानांतरित, वेंट्रल साइड अप के साथ। मछली के सिर ऑपरेटर के प्रमुख हाथ से दूर बात करनी चाहिए ।
2. पेरिकार्डियम में माइक्रोइंजेक्शन
- स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, मछली की त्वचा के नीचे धड़कन दिल के आंदोलन को ध्यान से देखें। नेत्रहीन धड़कन दिल के ऊपर इंजेक्शन बिंदु निर्धारित करते हैं और वेंट्रल कार्टिलाजिनस प्लेटों (चित्रा 1D)द्वारा परिभाषित त्रिकोण के बीच में। शरीर की धुरी (चित्रा 1E)के सापेक्ष 30−45 डिग्री कोण पर केशिका की नोक डालें। धीरे-धीरे त्वचा को पेरिकार्डियम (चित्रा 1C)में माइक्रोकैपिलरी की नोक के साथ प्रवेश करें। एक इष्टतम प्रवेश बिंदु सिर की तुलना में पेट के करीब है।
नोट: शरीर और दिल में केशिका को बहुत गहराई से न डालें, क्योंकि इससे अंग को चोट लगेगी। दिल पंचर होने की स्थिति में सुई आम तौर पर खून से भर देती है। यदि ऐसा होता है, तो केशिका को हटा दें और प्रयोग से मछली को बाहर करें। - एक बार सुई पेरिकार्डियम के अंदर हो जाने के बाद माइक्रोइंजेक्टर डिवाइस के पेडल को दबाकर पूरा इंजेक्शन लगा दें।
नोट: वक्ष गुहा में हवा इंजेक्ट न करने के लिए सावधान रहें। - इंजेक्शन के बाद, धीरे-धीरे छाती से केशिका वापस लें और तुरंत मछली को वसूली के लिए सिस्टम पानी के साथ एक टैंक में स्थानांतरित करें।
- संज्ञाहरण से कुल वसूली तक मछली की निगरानी करें।
- वांछित समय बिंदु पर दिल ले लीजिए और इसे आगे के विश्लेषण के लिए तैयार करें।
नोट: यदि मछली 30 एस के भीतर ऑपरक्यूलम की आवाजाही फिर से शुरू नहीं करती है, तो मछली को प्लास्टिक के पिपेट के साथ गिल्स में पानी निचोड़कर फिर से जीवित करें।
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Representative Results
चित्रा 1: वयस्क जेब्राफिश में इंट्राथोरेसिक (आईटी) इंजेक्शन। (क) फिलामेंट (6", व्यास में 1.0 मिमी) और सुई खींचने वाले कार्यक्रम के मूल्यों के साथ एक खींची गई माइक्रोइंजेक्शन केशिका की तस्वीर। (ख) फिलामेंट (6", व्यास में 1.0 मिमी) के साथ एक खींचे गए माइक्रोइंजेक्शन केशिका की तस्वीर जिसमें 10% फिनोल लाल युक्त समाधान के 2.5 माइक्रोनल से भरा गया है। सुई की खींची गई नोक अधिकतम 7 मिमी लंबी है। (ग) आईटी इंजेक्शन प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (घ) आईटी इंजेक्शन प्रक्रिया की तस्वीरें । यह आंकड़ा Bise एट अल से संशोधित किया गया है । पैनलों में संख्या सी और डी प्रक्रिया के एक ही चरण के अनुरूप है: (1) मछली एक आर्द्रीकृत स्पंज पर वेंट्रल साइड ऊपर रखा जाता है । पंचर साइट (त्रिकोण में लाल बिंदु) गिलों के पास छाती के केंद्र में स्थित है। (2) सुई का प्रवेश पेरिकार्डियम में। लाल डॉट पंचर साइट इंगित करता है। (3) पेरिकार्डियल गुहा में लाल समाधान के प्रसार को देख कर इंजेक्शन की निगरानी की जाती है। (ङ) आईटी इंजेक्शन की योजना। हृदय पंचर से बचने के लिए इंजेक्शन केशिका और शरीर की धुरी के बीच कोण 30 डिग्री और 45 डिग्री के बीच होना चाहिए। (च) संकेतित मात्रा के आईटी इंजेक्शन के 1 घंटे बाद मछली छाती की तस्वीरें । सफेद तीर लाल ऊतक पर इशारा कर रहे हैं, जो आंतरिक रक्तस्राव का संकेत हो सकता है
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Macroscope (binocular) | M400 | with Apozoom | |
| Micro-injector femtojet | Eppendorf | 5247 0034 77 | |
| Microloaders femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Micropipette glass needles type C | WPI | TW100F-6 | thin-wall capillary |
| Micropipette puller model P-87 | Flaming/Brown | 20081016 | filament box 2.5 mm x 4.5 mm |
| Sponge | any | any | dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 |
