Overview
Denne videoen beskriver teknikken for å levere forbindelser inn i hjertet av voksen sebrafisk ved å bruke intrathoracic injeksjon.
Protocol
1. Tilberedning av fisken for intrathoracic injeksjon
- Fang en voksen sebrafisk (Danio rerio) med et nett og overfør det til bedøvelsesløsningen.
- Etter 1-2 min, når fisk slutter å svømme og bevegelsen av operculum reduseres, berøre fisken med en plastskje for å sikre at den ikke reagerer på kontakt.
- Overfør fisken raskt og forsiktig med skjeen inn i sporet av den våte svampen, med ventral side opp. Fiskens hode skal peke bort fra operatørens dominerende hånd.
2. Mikroinjeksjon i Perikardium
- Under stereomikroskopet må du nøye observere bevegelsen av det bankende hjertet under fiskens hud. Visuelt bestemme injeksjonspunktet over det bankende hjertet og midt i trekanten definert av ventrale bruskplater (figur 1D). Sett inn spissen på kapillæren i 30-45° graders vinkel i forhold til kroppsaksen (figur 1E). Penetrer huden forsiktig med spissen av mikrokapillæren inn i perikardiet (figur 1C). Et optimalt inngangspunkt er nærmere magen enn til hodet.
MERK: Ikke sett kapillæren for dypt inn i kroppen og hjertet, da dette vil forårsake skade på orgelet. Ved hjerte punktering fyller nålen vanligvis med blod. Hvis dette skjer, fjern kapillæren og utelukke fisken fra eksperimentet. - Når nålen er inne i perikardiet, må du fullføre injeksjonen ved å trykke på pedalen på mikroinjektorenheten.
MERK: Pass på at du ikke injiserer luft i thoraxhulen. - Etter injeksjon trekker du forsiktig kapillæren fra thoraxen og overfører fisken umiddelbart til en tank med systemvann for utvinning.
- Overvåk fisken til total utvinning fra anestesi.
- Samle hjerte på ønsket tidspunkt og forberede det for videre analyse.
MERK: I tilfelle fisken ikke gjenopptar bevegelsen av operculum innen 30 s, reanimate fisken ved å klemme vann inn i gjellene med en plastpipette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: Intrathoracic (IT)-injeksjon hos voksne sebrafisk. (A) Fotografi av en trukket mikroinjeksjon kapillær med filament (6", 1,0 mm i diameter) og verdier av nåltrekkerprogrammet som brukes. (B) Fotografi av en trukket mikroinjeksjon kapillær med filament (6", 1,0 mm i diameter) fylt opp med 2,5 μL oppløsning som inneholder 10% fenol rød. Den trukket spissen av nålen er maksimalt 7 mm lang. (C) Skjematisk representasjon av IT-injeksjonsprosedyren. (D) Fotografier av IT-injeksjonsprosedyren. Denne figuren er endret fra Bise et al. Tall i panel C og D tilsvarer de samme trinnene i prosedyren: (1) fisk plasseres ventral side opp på en fuktet svamp. Punkteringsstedet (rød prikk i trekanten) ligger i midten av brystet nær gjellene. (2) Penetrasjon av nålen inn i perikardiet. Rød prikk indikerer punkteringssted. (3) Injeksjon overvåkes ved å observere spredningen av den røde oppløsningen i perikardhulen. (E) Ordning for IT-injeksjon. Vinkelen mellom injeksjonkapillæren og kroppsaksen skal være mellom 30° og 45° for å unngå hjertepunktering. (F) Fotografier av fisk thorax på 1 time etter IT-injeksjon av indikerte volumer. Hvite piler peker på det rødaktige vevet, noe som kan indikere intern blødning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Macroscope (binocular) | M400 | with Apozoom | |
| Micro-injector femtojet | Eppendorf | 5247 0034 77 | |
| Microloaders femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Micropipette glass needles type C | WPI | TW100F-6 | thin-wall capillary |
| Micropipette puller model P-87 | Flaming/Brown | 20081016 | filament box 2.5 mm x 4.5 mm |
| Sponge | any | any | dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 |
