Overview
Это видео описывает технику доставки соединений в сердце взрослых зебры с помощью внутриторакальной инъекции.
Protocol
1. Приготовление рыбы для внутриторакальной инъекции
- Поймать взрослогозебрафиша (Danio rerio)с сеткой и передать его в обезболивающее решение.
- Через 1-2 мин, когда рыба перестает плавать и движение оперкулума уменьшается, коснитесь рыбы пластиковой ложкой, чтобы убедиться, что она не реагирует на любой контакт.
- Быстро и осторожно перенесите рыбу ложкой в паз влажной губки, с вентральной стороной вверх. Голова рыбы должна указать от доминирующей руки оператора.
2. Микроинъекция в перикард
- Под стереомикроскопом внимательно наблюдайте за движением бьющееся сердце под кожей рыбы. Визуально определите точку инъекции над бьющимся сердцем и в середине треугольника, определяемого вентральными плотоядными пластинами (рисунок 1D). Вставьте кончик капилляра под углом 30–45 градусов по отношению к оси тела (рисунок 1E). Аккуратно проникайте в кожу кончиком микрокапильярия в перикард (рисунок 1С). Оптимальная точка входа ближе к животу, чем к голове.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не вставьте капилляр слишком глубоко в тело и сердце, так как это приведет к повреждению органа. В случае прокола сердца, игла обычно наполняется кровью. Если это произойдет, удалите капилляр и исключите рыбу из эксперимента. - Как только игла находится внутри перикардия, полная инъекция, нажав на педаль микроинъектора устройства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не вводить воздух в грудной полости. - После инъекции аккуратно свяйте капилляр с грудной клетки и немедленно перенесите рыбу в резервуар с системной водой для восстановления.
- Мониторинг рыбы до полного восстановления после анестезии.
- Соберите сердце в нужную точку времени и подготовь его к дальнейшему анализу.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если рыба не возобновит движение оперкулума в пределах 30 с, реанимировать рыбу, сжимая воду в жабры с пластиковой пипеткой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1: Внутриторакальная (IT) инъекция взрослых зебр. (A) Фотография вытащил микроинъекции капилляр с нитью (6", 1,0 мм в диаметре) и значения иглы шкив программы используется. (B) Фотография вытащил микроинъекции капилляр с нитью (6, 1,0 мм в диаметре) заполнены с 2,5 мл раствора, содержащего 10% фенол красный. Вытянутый кончик иглы максимально 7 мм в длину. (C) Схематическое представление процедуры инъекций ИТ. (D) Фотографии процедуры инъекций ИТ. Эта цифра была изменена из Bise и др. Цифры в панелях C и D соответствуют тем же этапам процедуры: (1) рыба помещается брюшной стороной вверх на увлажненной губке. Место прокола (красная точка в треугольнике) расположено в центре грудной клетки рядом с жабрами. (2) Проникновение иглы в перикард. Красная точка указывает на место прокола. (3) Инъекция контролируется путем наблюдения за распространением красного раствора в перикардиальной полости. (E) Схема ИТ-инъекций. Угол между инъекционным капилляром и оси тела должен быть между 30 и 45 ", чтобы избежать прокола сердца. (F) Фотографии грудной клетки рыбы через 1 час после ИТ-инъекции указанных объемов. Белые стрелки указывают на красноватую ткань, что может свидетельствовать о внутреннем кровотечении
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Macroscope (binocular) | M400 | with Apozoom | |
| Micro-injector femtojet | Eppendorf | 5247 0034 77 | |
| Microloaders femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Micropipette glass needles type C | WPI | TW100F-6 | thin-wall capillary |
| Micropipette puller model P-87 | Flaming/Brown | 20081016 | filament box 2.5 mm x 4.5 mm |
| Sponge | any | any | dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 |
